丙酮酸脱羧酶(PDC)活性检测试剂盒 微量法

丙酮酸脱羧酶（PDC）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 提取液：内含不溶物，使用前摇匀；

2、 试剂一的配制：临用前配制，将试剂一 B、试剂一 C 加入到试剂一 A 中并充分溶解。-20℃分装保存，可保存 1 个月。

3、 试剂二 B：临用前加入 0.3mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存两周。

4、 试剂二 C：临用前加入 1mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存两周。

5、 试剂二的配制：临用前配制，取 1.305mL 试剂二 A、0.12mL 试剂二 B、0.075mL 试剂二 C 混合（共 1.5mL，约 75T），现用现配。

产品说明：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340nm有吸收峰，而NAD+没有；通过测定340nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/ 96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。16000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。

2、组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰上充分研磨。16000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样本：直接检测。

二、操作步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 根据样本数取适量试剂一、试剂三37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴提前预热30min.

3、 操作表：

迅速混匀后于 340nm 比色，记录 10s 和 70s 的吸光值，测定管的记为 A1 和 A2，空白管的记为 A3 和 A4，计算 ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）。（空白管只需做 1-2 次）

三、PDC活性计算

注意事项：

1、 实验时，试剂二和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入

37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最 好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。使用 96 孔板测定时不推荐同时测多个样本。

4、如果 1 分钟变化值较小可延长反应时间，同时注意修改计算公式。

实验实例：

1、 取 0.1g 绿萝叶加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）=（0.9557-0.9299）-（0.7363-0.7301）=0.0196，按样本质量计算酶活得：

PDC（U/g 质量）=1.6×ΔA÷W=1.6×0.0196÷0.1=0.3136 U/g 质量。

2、 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清稀释 40 倍后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）=（0.703-0.468）-（0.7363-0.7301）=0.2288，按样本质量计算酶活得：

PDC（U/g 质量）=1.6×ΔA÷W=1.6×0.2288÷0.1×40（稀释倍数）=146.432 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！