乙酰辅酶A含量检测试剂盒 微量法

乙酰辅酶 A 含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取 1 支先将液体甩离至管底，然后加入 125μL 试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；

2、 试剂二：临用前取 1 支先将液体甩离至管底，然后加入 125μL 试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；

3、 试剂三：临用前取 1 瓶试剂三 B 加入 12mL 试剂三 A，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；

4、 工作液：临用前将试剂一、二和三按照 1:1:90 的比例混合，根据样本量现配现用。

产品说明：

乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸、酮体、胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。

苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD+生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、天平、水浴锅/恒温培养箱、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：建议称取约 0.1g 样本，加入 0.99mL 提取液一和 0.01mL 提取液二进行冰浴匀浆。于 4℃，8000g 离心10min，取上清，置于冰上待测。

2. 细胞或细菌：建议取 500 万细胞或细菌加入 0.99mL 提取液一和 0.01mL 提取液二，冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 200w，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），于 4℃，8000g 离心 10min，取上清，置于冰上待测。

3. 血清（浆）或其他液体：直接检测，若液体有浑浊则离心后测定。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 将工作液37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热10min。

3. 取50μL样本和205μL工作液至微量石英比色皿或96孔UV板，混匀，立即记录340nm处20s的吸光值A1和80s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

三、乙酰辅酶 A 含量计算

实验实例：

1. 称取 0.1g 兔肾加入 0.99mL 提取液一和 0.01mL 提取液二进行匀浆研磨，离心后取上清，稀释 2 倍后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA= A2-A1=0.8083-0.7691=0.0392，按样本质量计算酶活得：

乙酰辅酶 A 含量（nmol/g 质量）＝819.9×0.0392÷0.1×2=642.8 nmol/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！