硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒（Griess显色法）可见分光光度法

硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒（Griess 显色法）说明书

可见分光光度法

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 诱导液：将诱导剂储备液用蒸馏水 10 倍稀释后使用，即取 10 mL 诱导剂储备液加 90 mL 蒸馏水，充分混匀。现配现用。

2、 试剂二：加入 1mL 蒸馏水，-20℃分装保存，可以-20℃保存 2 周。临用前用蒸馏水将试剂二稀释 50 倍，备用，即取 10 μL 试剂二加入 490 μL 蒸馏水混匀。

3、 标准品：10 μmol/mL 亚硝酸钠标准溶液。临用前将用蒸馏水标准溶液稀释 100 倍得到 0.1 μmol/mL 的亚硝酸钠标准液，备用。

产品说明：

NR（EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO₃ˉ +NADH+H＋→NO2ˉ+NAD_＋+H₂O。在酸性条件下，产生的NO2ˉ能够参与重氮化反应生成紫红色化合物，这种紫红色化合物在 540 nm 处有吸收峰，540 nm 下吸光值的变化即可表示酶活。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅/培养箱、台式离心机、1 mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织前处理：

（1） 取适量诱导液于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导液中（淹没即可），避光浸泡 2 h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻 30 min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理，一般不需要诱导处理，预实验结果没有活性则需要进行诱导处理）

（2） 按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL 提取液)，冰浴研磨，8000g，4℃离心 10 min，取上清置冰上待测。

2、细胞或细菌的前处理：

先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30 min以上，调节波长至540 nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定：

三、NR活性计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每小时每 mg 组织蛋白催化产生 1 μmol NO₂-的量为 1 个 NR 活力单位。

NR 活力（U/mg prot）= C 标准×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）×V 样本÷（V 样本×Cpr）÷T×F

= 0.2×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）÷Cpr×F

（2）按样本质量计算：

酶活定义：每小时每 mg 组织催化产生 1 μmol NO2

-的量为 1 个 NR 活力单位。

NR 活力（U/g 质量）=C 标准×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）×V 样本÷（W×V 样本÷V 提取）÷T×F

= 0.2×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）÷W×F

（3）按细胞数量计算：

酶活定义：每小时每 1 万个细胞或细菌催化产生 1 μmol NO2-的量为 1 个 NR 活力单位。

NR 活力（U/10⁴ cell）

=C 标准×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）×V 样本÷（细胞或细菌数量×V 样本÷V 提取）÷T×F=0.2×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）÷细胞或细菌数量×F

C 标准：亚硝酸钠标准溶液浓度，0.1 μmol/mL；V 提取：加入提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，0.5 h；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V 样本：加入的样本体积，0.1 mL；细胞或细菌数量：以万计；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1. 吸光度大于 0.8 时，建议用提取液稀释样本，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！