磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒 微量法

磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 17 mL 试剂一和 1.13 mL 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴 5 分钟，用不完的试剂-20℃分装保存一周；

2、 试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为 1:50 的体积比例充分混匀，现用现配；用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存，避免反复冻融；

3、 试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为 1:125 的体积比例充分混匀，现用现配。

产品说明：

PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和 ATP 转化为果糖二磷酸和 ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-二磷酸和 ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD⁺，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PFK 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或 96 孔板（UV）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 细菌或培养细胞：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）提取液体积（mL）为 500-1000：1的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或者 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、 组织：

按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、 血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定：

在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三、10μL 试剂四和 170μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1，比色后迅速将比色皿或 96 孔板连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴或恒温箱中，准确反应 10 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，记录 10 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。

三、PFK 活力单位的计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

注意事项：

1. 测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2. 比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4. 不同匀浆组织中 PFK 活力不一样，做正式试验之前请坐 1-2 个预实验，若 ΔA>0.5，则说明活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min 或 5min，使ΔA<0.5，以提高检测的灵敏度。

实验实例：

1、 取 0.1g 黑麦草加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算

ΔA=A1-A2=1.6086-1.2986=0.31，按样本质量计算酶活得：

PFK（U/g 质量）=535×ΔA÷W=535×0.31÷0.1=1658.5 U/g 质量。

2、 取 0.1g 桃叶加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算

ΔA=A1-A2=1.7025-1.6159=0.0866，按样本质量计算酶活得：

PFK（U/g 质量）=535×ΔA÷W=535×0.057÷0.1=463.31 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！