总巯基含量检测试剂盒 微量法

总巯基含量检测试剂盒说明书

 微量法

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

标准品：10 mg 还原型谷胱甘肽（GSH）。临用前加入 1.3 mL 蒸馏水，配制成 25 μmol/mL，2-8℃保存两周。

产品说明：

生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质，而且参与活性氧清除，后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和GSH含量，能够间接测定蛋白质巯基含量。巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最 大吸收峰。

技术指标：

最 低检出限：0.0088 μmol/mL

线性范围：0.015625-1 μmol/mL

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、台式离心机、恒温水浴锅、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 动物、植物组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（称取称取约 0.1g 组织，加入 1mL的提取液），冰浴匀浆，8000g，常温离心 10min，取上清待测。

2. 血清，培养液：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。

二、 测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、标准液的稀释：将25μmol/mL标准溶液用蒸馏水稀释至0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μmol/mL的标准液，现用现配。

3、 标准液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需 40μL 标准溶液。

4、 操作表

三、计算公式

1、标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（y，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（x，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（x，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（y，μmol/mL）。

2、总巯基含量计算：

（1）按样本质量计算：总巯基含量（μmol/g 质量）=y×V样总÷W=x÷W

（2）按样本蛋白浓度计算：总巯基含量（μmol/mg prot）=y×V样总÷（Cpr×V样总）=y÷Cpr

（3）按血清、培养液体积计算：总巯基含量（μmol/L）=y×V样÷（V样×10^-3）=1000y

V样总：加入提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.04mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；10^-3：单位换算系数，1mL=10^-3L。

注意事项：

如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！