顺乌头酸酶活性检测试剂盒 微量法

顺乌头酸酶（ACO）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

试剂三：易挥发试剂，使用后尽快拧紧盖子放入-20℃保存。

产品说明：

顺乌头酸酶（Aconitase, ACO）是细胞内一种重要的铁硫蛋白酶，主要存在于胞浆与线粒体中。ACO 催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸的可逆反应，对维持三羧酸循环及乙醛酸循环的顺利进行起着重要作用。

顺乌头酸酶催化异柠檬酸生成顺乌头酸，顺乌头酸在 240nm 有特征吸收峰，通过检测顺乌头酸的产生速率来计算该酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、顺乌头酸酶的提取：（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

A、总顺乌头酸酶的提取：

称取约 0.1g 组织或收集 500 万个细胞（细菌），加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。将匀浆置于冰上超声波破碎（功率 40%，超声 3 秒，间隔 9 秒，重复 15 次），4℃，11000×g 离心 15min，取上清置于冰上待测（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr1）。用于测定总顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测）。

B、胞浆与线粒体中顺乌头酸酶的提取：

(1) 称取约 0.2 g 组织或收集 1000 万个细胞，加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。

(2) 4℃，600×g 离心 5min。（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr2）。

(3) 将上清液移至另一离心管中，4℃，11000×g 离心 15min。

(4) 上清液即胞浆提取物，用于测定胞浆中的顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测）。

(5) 在沉淀中加入 400μL 试剂二与 4μL 试剂三，置于冰上超声波破碎（功率 40%，超声 3 秒，间隔 9 秒，重复 15次），4℃，5000×g 离心 2min，取上清置于冰上待测。用于测定线粒体中顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测）。

注意：根据实验需要选择性提取细胞总顺乌头酸酶、胞浆乌头酸酶或线粒体乌头酸酶。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至240nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定

（1） 工作液的配制：临用前将试剂五和试剂六加入到试剂四中，充分溶解待用，用不完的试剂 4℃避光保存；

（2） 将工作液 25℃预热 15min 以上；

（3） 在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入：

三、顺乌头酸酶活性的计算

A、按微量石英比色皿计算：

1、总顺乌头酸酶活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V 样×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N

（2） 按样本质量计算

酶活定义：每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V 样÷V 提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

（3） 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V 样÷V 提取×细胞数量（万个））÷T×N

=561.11×ΔA÷细胞数量（万个）×N

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 提取：样本总体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr1：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁶：单位换算系数，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀释倍数。

2、胞浆顺乌头酸酶活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V 样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

（2） 按样本质量计算

酶活定义：每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V 样÷V 提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

（3） 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V 样÷V 提取×细胞数量（万个））÷T×N

=561.11×ΔA÷细胞数量（万个）×N

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 提取：胞浆样本总体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr2：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁶：单位换算系数，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀释倍数。

3、线粒体顺乌头酸酶活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V 样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

（2）按样本质量计算

酶活定义：每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V 样÷V 样总×W）÷T×N=244.44×ΔA÷W×N

（3） 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1 nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活（U/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个）÷T×N

=244.44×ΔA÷细胞数量（万个）×N

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6 L/mmol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：线粒体样本总体积，0.404mL；T：反应时间，5min；Cpr2：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁶：单位换算系数，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀释倍数。

B、按 96 孔 UV 板计算：

将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1、 A 大于 1 时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，并在计算时乘以相应的稀释倍数。

2、 当 ΔA 小于 0.01 时，可适当延长反应时间，并在计算时将实际反应时间（T）带入计算公式。

3、 测定蛋白浓度时，由于试剂一本身含有蛋白（约 1 mg/mL）所有测定时需要扣除此部分蛋白。

实验实例：

1. 取 0.1g 画眉草样本，加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三进行总顺乌头酸酶的提取，取上清稀释 4 倍，用微量石英比色皿测得 ΔA=A2-A1=0.5693-0.5571=0.0122，按样本质量计算总顺乌头酸酶的酶活得：

ACO 酶活(U/g 质量)=561.11×ΔA÷W×N=273.8217 U/g 质量。

2. 取 0.1g 兔子肾脏样本，加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三进行总顺乌头酸酶的提取，取上清稀释 8 倍，用微量石英比色皿测得 ΔA=A2-A1=0.4520-0.4186=0.0334，按样本质量计算总顺乌头酸酶的酶活得：

ACO 酶活(U/g 质量)=561.11×ΔA÷W×N=1499.2859 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！