DPPH 自由基清除能力检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
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溶液的配制:
1、 试剂一:无水乙醇自备;
2、 试剂二:粉剂置于瓶内 EP 管中。临用前加入 6.08 mL 试剂一振荡溶解,用不完的试剂可于-20℃保存 1
个月,建议分装保存,避免反复冻融;临用前根据试验所需量按照试剂二:试剂一(V:V)= 4:21 的比例配制成工作液,现配现用,用不完的工作液可于 2-8℃保存一周;
3、 试剂三:10 mg 维生素 C。临用前加入 1 mL 提取液,充分振荡溶解,配成 10 mg/mL 维生素 C 溶液,2-8℃保存两周;用于阳性对照。
产品说明:
DPPH 自由基一种很稳定的氮中心的自由基,是样本抗氧化能力的重要指标之一,广泛应用于抗氧化类食品、保健品及药品的研究中。
DPPH 自由基有单电子,其醇溶液呈紫色,在 515 nm 处有强吸收。当有抗氧化剂存在时,DPPH 自由基被清除,其溶液颜色变浅,515 nm 的吸光度下降,在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。本试剂盒中,通过吸光度下降的程度来反映样本清除 DPPH 自由基的能力。
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注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅、台式离心机、无水乙醇、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50 目筛和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本的制备(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
(1)植物样本的制备:将新鲜样本置于 60℃烘箱烘干至恒重,研钵研碎(或粉碎机粉碎),过 30~50 目筛。称取约 0.05 g 样本,加入 1 mL 提取液,40℃水浴浸提 30 min。室温 10000 rpm 离心 10 min,取上清,置冰上待测。
(2)红酒、果汁等液体样本:吸取 100 μL 样本溶液加入 900 μL 提取液,旋涡振荡混匀,室温 10000 rpm 离心 10 min,取上清,置冰上待测。
(3)提取物或者药物:可用提取液配制成一定浓度,如 5 mg/mL。
注意:不同样本清除 DPPH 自由基的能力可能相差很大,为保证实验结果的准确性,样本要根据预实验结果进行适当调整(如清除率大于 90%,建议将提取的样本用提取液进行稀释;清除率小于 5%,建议加大烘干样本质量或液体样本体积进行提取)。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 515 nm,无水乙醇调零。
2、阳性对照的准备:若需要线性关系,建议将 10 mg/mL 的维生素 C 溶液用提取液配制成 0.3、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL 的维生素 C 溶液待用,稀释可参考下表;若需要清除率约为 100%的阳性对照,则建议将 10 mg/mL 维生素 C 溶液用提取液配制成大于 0.3 mg/mL 的维生素 C 溶液待用。
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3、操作表:在 1.5 mL EP 管中分别加入下列试剂
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三、计算公式
1、阳性对照的自由基清除率计算公式:
DPPH 自由基清除率 DVC% =[(A 空白-A 阳性对照)÷A 空白]×100 %
2、样本的自由基清除率计算公式:
DPPH 自由基清除率 D% =[[A 空白-(A 测定-A 对照)]÷A 空白]×100 %
注意事项:
1、不同样本清除 DPPH 自由基的能力可能相差很大,如果要比较不同样本的 DPPH 自由基清除能力,建议对于同一批样本加入等量的样本,红酒、组织匀浆、果汁等液体样本加入同样体积,提取物(或者药物)配制成同样浓度。在比较时,将样本根据预实验结果进行适当调整,比较同样浓度(相同稀释倍数)的清除率大小。
2、样本建议当天提取当天检测。
实验实例:
1、 称取 0.05g 益母草叶片加入 1mL 提取液进行样本处理,离心取上清后按测定步骤操作,测得 A 空白=1.037、A对照=0.088、A 测定=0.228,根据计算公式得:
DPPH 自由基清除率 D% =[[A 空白-(A 测定-A 对照)]÷A 空白]×100 %=86.5%。
2、 取 100μL 红酒加入 900μL 提取液进行样本处理,离心取上清后按测定步骤操作,测得 A 空白=1.037、A 对照=0.012、A 测定=0.760,根据计算公式得:
DPPH 自由基清除率 D% =[[A 空白-(A 测定-A 对照)]÷A 空白]×100 %=27.9%。
3、 称取 0.05g 枸杞加入 1mL 提取液进行样本处理,离心取上清稀释 20 倍后按测定步骤操作,测得 A 空白=1.037、A 对照=0.005、A 测定=0.829,根据计算公式得:
DPPH 自由基清除率 D% =[[A 空白-(A 测定-A 对照)]÷A 空白]×100 %=20.5%。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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