抗坏血酸(AsA)含量检测试剂盒 微量法

抗坏血酸（AsA）含量检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1．试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂三:试剂二为 1:250 的体积比例充分混匀，现用现配；

2．标准品：临用前配置，加入5.679 mL蒸馏水充分溶解，即10 mmol/L AsA；吸取0.04mL上述溶液，加入0.96mL蒸馏水，混匀，即 400 μmol/L AsA。

产品说明:

AsA又称维生素c。AsA是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂，AsA在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻重的作用，也是衡量农作物产品品质的重要指标之一。

抗坏血酸氧化酶（AAO）催化AsA氧化生成DHA，通过测定AsA的氧化速率，即可计算出AsA含量。

技术指标：

最 低检出限：0.7539 μmol/L

线性范围：6.25-1400 μmol/L

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

研钵/匀浆器、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2、细菌、细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g，4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。

3、血清等液体：直接测定。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。

2、 试剂二在25℃水浴锅中预热30min以上。

3、 标准管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL标准液、160μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于265nm测定，记录30s和150s的吸光值A1和A2。ΔA标准管=A1-A2。

4、 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于265nm测定，记录30s和150s的吸光值A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。

注意：如果样本数量较大。可将试剂二与试剂三按照8:1的体积比混匀配成工作液使用，根据样本所需现配现用，禁止一次性配完。加样顺序为180 μL工作液、20 μL上清液（或标准液），加入上清液（或标准液）即开始计时。（标准管只需测定1-2次）

三、AsA 含量计算公式

1、 按蛋白浓度计算：

AsA (nmol/mg prot) =（C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样）÷（Cpr×V样）=400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷Cpr

2、 按样本质量计算：

AsA(nmol/g 质量) =（C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样）÷(W×V样÷V样总) =400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷W

3、 按细胞数量计算：

AsA(nmol/10⁴ cell) =（C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样）÷(细胞数量×V样÷V样总)

=400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷细胞数量

4、 按液体体积计算：

AsA (nmol/mL) =（C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样）÷V样=400×ΔA测定管÷ΔA标准管

C标准液：标准液的浓度，400μmol/L=400nmol/mL；V样总：上清液总体积，1.0mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；细胞数量：以104为单位计量，万。

注意事项：

1、 试剂三和标准品现配现用，配制好的 4℃保存，3 天内使用完。

2、 如果样本初始吸光值大于 1.4，建议将样本用试剂一稀释后进行测定。

实验实例：

1、 取 0.1g 山楂加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 20min，取上清置冰上，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 Δ 测定管=A3-A4=1.0228-0.6627=0.3601，ΔA 标准管=A1-A2=0.3660-0.0090=0.3570，按样本质量计算含量得：

AsA(nmol/g 质量) =400×ΔA 测定管÷ΔA 标准管÷W =4035 nmol/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！