3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。根据用量按照试剂三:蒸馏水为 3:100 的体积比例充分混匀,现用现配;
2、 工作液的配制:将试剂二全部倒入试剂一瓶中,充分溶解,根据需要取一定的量 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
产品说明:
GAPDH(EC1.2.1.12)催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3-二磷酸甘油酸和NADH 生成 3-磷酸甘油醛、无机磷和 NAD+,340nm 处测定 NADH 的减少量可反映 GAPDH 活性的高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心 20min,取上清,置冰上待测。
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。血清(浆):直接检测。
二、测定步骤:
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 操作表(在微量石英比色皿或 96 孔板中分别加入下列试剂):
三、GAPDH 酶活计算:
注意事项:
1、 当 A1 小于 0.8 或 ΔA 大于 0.7 时(96 孔板为 A1 小于 0.4 或 ΔA 大于 0.4),建议将样本稀释后再进行测定。
2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.02。
实验实例:
1.取 0.1g 兔肾脏加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 8000g,4℃,离心 20min,取上清置冰上,之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=0.9333-0.2289=0.7044,ΔA 空白管=A1空白-A2 空白=0.9322-0.9274=0.0048,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.6996,按样本质量计算酶活得:
GAPDH 酶活(U/g 质量)=1072×ΔA÷W=7499.7 U/g 质量。
2.取 0.1g 三叶草加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 8000g,4℃,离心 20min,取上清置冰上,之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=1.0184-1.0042=0.0142,ΔA 空白管=A1空白-A2 空白=0.9322-0.9274=0.0048,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.0094,按样本质量计算酶活得:GAPDH 酶活(U/g 质量)=1072×ΔA÷W=100.77 U/g 质量。
3.取兔血清直接检测,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.9528-0.9303=0.0225,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.9322-0.9274=0.0048,按血清(浆)体积计算酶活得:GAPDH 酶活(U/mL)=1072×ΔA=18.974 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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企业名称
上海博尔森生物科技有限公司
企业信息已认证
企业类型
信用代码
91310117MA1J4K3L3L
成立日期
2020-09-02
注册资本
100
经营范围
一般项目:从事生物科技、医药科技领域內的技术开发、技术咨询、技术服务;仪器仪表、实验室设备及耗材、玻璃制品、电子产品、第一类医疗器械、化工原料及产品(除危险化学品、监控化学品、烟花爆竹、民用爆炸物品、易制毒化学品)销售;货物或技术进出口(国家禁止或涉及行政审批的货物和技术进出口除外)
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