γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)活性检测试剂盒 微量法

γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）活性检测试剂盒说明书

 微量法

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加 6 mL 蒸馏水充分震荡溶解，用不完的试剂-20℃分装保存，禁止反复冻融；

2、 试剂三：临用前加 5 mL 蒸馏水充分震荡溶解；

3、 试剂五：临用前加入 12 mL 蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入 400 μL 浓硫酸（自备），边加边搅拌；

4、 标准品：1 μmol/mL磷标准溶液。临用前将标准液用蒸馏水稀释成0.1 μmol/mL磷标准溶液。

产品说明：

GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、浓硫酸和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2、 加样表：

三、GCL活性计算

注意事项：

1、 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。

2、 样本测定前先取 1-2 个样做预实验，如吸光值大于 1，应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数，哺乳动

物组织和血液一般稀释 3-5 倍。

3、 细胞中 GCL 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GCL 的提取时可加试剂一（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。

4、 试剂三配制完成后，请一周内使用完。

5、 试剂五配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。该溶液配制完成后应为浅黄色，若为蓝色则已污染，不可再使用。

6、 测定吸光值时请于水浴后 10-40 分钟内测完。

实验实例：

1、 取 0.1g 三叶草加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=0.784-0.415=0.369，ΔA标=A标准管-A空白管=0.371-0.042=0.329，按样本质量计算酶活得：

GCL（U/g 质量）=0.0544×ΔA 测÷ΔA 标÷W=0.61 U/g 质量。

2、 取 0.1g 柳树加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，用 96孔板测得计算 ΔA 测=A 测定管-A 对照管=0.530-0.366=0.164，ΔA 标=A 标准管-A 空白管=0.371-0.042=0.329，按样本质量计算酶活得：

GCL（U/g 质量）=0.0544×ΔA 测÷ΔA 标÷W=0.271 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！