肉桂酸-4-羟化酶（C4H）活性检测试剂盒 紫外分光光度法

肉桂酸-4-羟化酶（C4H）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 3 mL 乙醇溶解备用。2-8℃保存 4 周。

2、 试剂三：临用前每瓶加入 3 mL 双蒸水充分溶解待用。现配现用。-20℃分装可保存 4 周，避免反复冻融。

产品说明：

C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌类中，属于细胞木质素合成途径中间的关键酶。

C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸盐和NADP，在340nm下测定NADPH的减少速率，即可反映C4H活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g， 4℃离心 15 分钟，取上清，置冰上待测。

2、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。12000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min，波长调至340nm，蒸馏水调零。

2、 加样表（在1mL石英比色皿中分别加入）

充分混匀后立即测定10s时在340nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃水浴或37℃培养箱中3min。然后迅速拿出擦净后测定 190s 时的吸光度，记为 A2。计算ΔA=A1-A2。

三、C4H酶活计算

注意事项：

当ΔA大于0.4时，建议将样本用提取液稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间（5min或10min）或增加加入的样本体积来测定。

实验实例：

1. 取 0.1g 黄 豆 （ 发 芽 ） 加 入 1mL 提 取 液 进 行 匀 浆 研 磨 ， 取 上 清 后 按 照 测 定 步 骤 操 作 ， 测 得 计 算ΔA=A1-A2=1.643-1.510=0.133，按样本质量计算酶活得：

C4H 酶活（U/g 质量）=535.91×ΔA÷W=535.91×0.133÷0.1=712.76 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！