肌酸含量检测试剂盒（酶法）可见分光光度法

肌酸含量检测试剂盒（酶法）说明书

 可见分光光度法

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

试剂一：临用前每支加入 1 mL 蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存。

试剂二：临用前每支加入 0.2 mL 蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存。

试剂三：临用前每支加入 0.5 mL 蒸馏水（100T/48S），充分溶解。为方便储存故多给一支。用不完的试剂分装后-20℃保存。

试剂四：临用前根据试验所需用量，按照试剂四 A 液：试剂四 B 液=1:1，充分混匀，现用现配。

标准品：1 mg 一水肌酸。临用前加入 1 mL 蒸馏水，充分溶解，即 1 mg/mL 一水肌酸标准储备液。临用前取 20μL和 80μL 蒸馏水混合配制成 200μg/mL 作为标准溶液待测。现用现配。

产品说明：

肌酸(Creatine)是一种含氮化合物，自然存在于脊椎动物体内，能够辅助为肌肉和神经细胞提供能量。肌酸可由精氨酸（arginine)、甘氨酸（glycine）及甲硫氨酸（methionine）三种氨基酸合成，可由人体自行合成，也可以从食物中摄取。大约 95%的肌酸存在于骨骼肌中，主要存在形式为磷酸肌酸。肌酸作为一种补充剂主要通过增加肌肉质量，增强运动表现能力。肌酸也被作为神经肌肉疾病的一种治疗药被广泛研究，它可能有助于保护神经和改善细胞生物功能状态。

肌酸酶偶联肌氨酸氧化酶，可将肌酸转化为甘氨酸、甲醛、过氧化氢，过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在 505nm 有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、超声破碎仪。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞样本的制备：按照细胞数量（10⁴个）: 提取液一体积（mL）为 500~1000 : 1 的比例（建议 500万细胞加入 1 mL 提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300W，超声 3 秒，间隔 9 秒，总时间 5 min）；于 4℃，12000g 离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，4℃，12000 g 离心 10 min 后取上清待测。

2、组织样本的制备：按照质量（g）: 提取液一体积(mL)为 1: 5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于 4℃，12000 g 离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，4℃，12000 g 离心 10 min 后取上清待测。

3、血清（浆）：取 100 μL 血清（浆）加入 1 mL 提取液一，4℃，12000 g 离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，4℃，12000 g 离心 10 min 后取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 505 nm，蒸馏水调零。

2、 按下表步骤加样：

三、肌酸含量计算

1、 计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

肌酸含量（μg/mg prot）=C 标×ΔA 测÷ΔA 标×V 样÷（V 样×Cpr）×0.879=175.8×ΔA 测÷ΔA 标÷Cpr

（2）按照样本质量计算

肌酸含量（μg/g 质量）=C 标×ΔA 测÷ΔA 标×（V 上清+V 提取液二）÷（W×V 上清÷V 提取液一）×0.879

=208.76×ΔA 测÷ΔA 标÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

肌酸含量(μg/10⁴ cell) = C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷(细胞数量×V 上清÷V 提取液一)×0.879

= 208.76×ΔA 测÷ΔA 标÷细胞数量

（4）按照血清（浆）体积计算

肌酸含量(μg/mL) =C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体×V 上清÷(V 提取液一+V 液体)]×0.879

=2296.39×ΔA 测÷ΔA 标

C 标：标准管浓度，200 μg/mL；V 样：加入样本体积，50 μL=0.05mL；V 上清：提取时上清液体积，0.8mL；V 提取液一：加入提取液一体积，1 mL；V 提取液二：加入提取液二体积，0.15 mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细胞数量：以 10⁴计；V 液体：液体样本体积，0.1 mL；0.879：换算系数，一水肌酸相对分子质量 149.15，无水肌酸相对分子质量 131.13，0.879=131.13÷149.15。

注意事项：

1、 显色完成后，请在 10 min 之内完成检测。

2、 提取液中含有蛋白沉淀剂，提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酐含量需要另取组织或血清（浆），即取相同质量（体积）的组织（血清（浆））用 1.1875mLPBS（生理盐水）匀浆（相当于提取步骤最终样本上清液），用 BCA 法进行蛋白浓度测定。

3、 如果测定吸光值超过标准管吸光值，建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定。如果测定吸光值过小，建议增大样本量后再进行测定。

实验实例

1、 取 0.1g 大鼠肌肉加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨离心，取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二，离心取上清后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测=A 测定-A 对照=0.752-0.012=0.74，ΔA 标= A 标准-A 空白=0.672-0.014=0.66。

按样本质量计算含量得：

肌酸含量（μg/g 质量）=208.76×ΔA 测÷ΔA 标÷W =2340μg/g 质量。

2、 取 100μL 牛血清加入 1mL 提取液一，取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测=A 测定-A 对照=0.061-0.016=0.045，ΔA 标= A 标准-A 空白=0.672-0.014=0.66。按照液体体积计算含量得：

肌酸含量（μg/mL）=2296.39×ΔA 测÷ΔA 标=156.57 μg/mL 血清。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！