线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒 微量法

线粒体复合体Ⅳ活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

工作液的配制：临用前取试剂一、试剂二、试剂三，将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中混合溶解。

产品说明：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧生成水。还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4 ℃ 600g 离心 10min。

2. 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g 离心 15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入 400uL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 15 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、 将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育15min；用不完的试剂4℃可保存一周；

3、 样本测定（在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入）

立即混匀，分别记录测定管和空白管 550nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，测定管的记为 A1 测定管，A2 测定管，空白管的记为 A1 空白管，A2 空白管。计算 ΔA1=A1 测定管-A2 测定管，ΔA2=A1 空白管-A2空白管，ΔA=ΔA1-ΔA2。

三、复合体Ⅳ活力单位的计算

注意事项：

实验实例：

1、 取 0.1g 兔肝脏进行样本处理，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿 ΔA2=A1 空白管-A2 空白管=0.7713-0.7669=0.0044，上清液的 ΔA1=A1 测定管-A2 测定管=0.7985-0.7754=0.0231，ΔA 上清=ΔA1-ΔA2=0.0231-0.0044=0.0187，沉淀中的 ΔA1=A1 测定管-A2 测定管=0.8843-0.7415=0.1428，ΔA 沉淀=ΔA1-ΔA2=0.1428-0..0044=0.1384，按样本质量计算：

上清液中复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=1099×ΔA 上清÷W=1099×0.0187÷0.1=205.513 U/g 质量

沉淀中复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=440×ΔA 沉淀÷W=440×0.1384÷0.1 =608.96 U/g 质量

则样本复合体Ⅳ总活力（U/g 质量）=1099×ΔA 上清÷W+440×ΔA 沉淀÷W

                    =1099×0.0187÷0.1+440×0.1384÷0.1=814.473 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！