关于fluidot自动移液工作站在食品中黄曲霉毒素B1检测(ELISA法）中的应用

关于fluidot自动移液工作站在食品中黄曲霉毒素B1检测(ELISA法）中的应用方案摘要：酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定 技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记 的抗原抗体反应 在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法 和间接法。方案详情：一、实验原理试样中的黄曲霉毒素Ｂ１用甲醇水溶液提取，经均质、涡旋、离心（过滤）等处理获取上清液。被辣根过氧化物酶标记或固定在反应孔中的黄曲霉毒素Ｂ1，与试样上清液或标准品中的黄曲霉毒素Ｂ1竞争性 结合特异性抗体。在洗涤后加入相应显色剂显色，经无机酸终止反应，于450ｎｍ 或630ｎｍ 波长下检 测。样品中的黄曲霉毒素Ｂ１与吸光度在一定浓度范围内呈反比。二、实验准备1、试剂和材料：配制溶液所需试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定二级水。 按照试剂盒说明书所述，配制所需溶液。 所用商品化的试剂盒需验证合格后方可使用。2、仪器和设备：①fluidot自动移液工作站，FDT-M8-4-300②微孔板酶标仪：带450与630nm（可选）滤光片③研磨机④振荡器  SPP-SK-500⑤电子天平：感量0.01g⑥离心机：转数≥6000r/min⑦快速定量滤纸：孔径11μｍ⑧筛网：１ｍｍ～２ｍｍ孔径⑨黄曲霉毒素Ｂ１试剂盒及所要求其它仪器三、实验步骤 （在 20-24℃条件下操作）1、称取至少１００ｇ样品，固体样品用研磨机进行粉碎，粉碎后的样品过１ｍｍ～２ｍｍ孔径试验筛。取５.０ｇ样品于５０ｍＬ离心管中；液体样品取１００ｇ待测样品摇匀，称取５.０ｇ样品于５０ｍＬ离心管中，加入试剂盒所要求提取液。2、将处理好的样品与试剂盒中的96微孔板、标准品、酶标记物试剂、抗体溶液、显色剂、终止液放置fluidot自动移液工作站的托盘与适配器中。 3、仪器自动取1个吸头吸取标准或处理好的样品加50ul到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。4、仪器自动取8个吸头吸取稀释了的酶标记物加50ul到微孔板底部，丢弃吸头。 5、自动取8个吸头吸取抗体溶液加50ul到每一个微孔底部，小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合。在室温下（20℃-25 ℃）孵育30分钟，丢弃吸头。6、倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将 250ul 洗涤缓冲液加入孔中。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。 7、自动取8个吸头取基质/显色剂加100ul到微孔中，充分混合并在室温（20℃-25℃）暗处孵育 15 分钟，丢弃吸头。8、自动取8个吸头取反应终止液加入100ul 到微孔中充分混合。混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，必须在加入停止液后15分钟内读取光度值。 四、结果1、酶联免疫试剂盒定量检测的标准工作曲线绘制所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。 计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素 B1 浓度（ng/kg）的 半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度（ng/kg）可以从标准曲线上读出。请注意 ：为了获得样品中的黄曲霉毒素 B1 的实际浓度（ng/kg），从标准曲线上读出的浓度值。2、待测液浓度计算按照试剂盒说明书提供的计算方法以及计算机软件，将待测液吸光度代入曲线图所获得公式，计算得待测液浓度（ρ）。3、结果计算食品中黄曲霉毒素Ｂ１的含量计算： 计算结果保留小数点后两位。 阳性样品需用第一法、第二法或第三法进一步确认。4、精密度 每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果。 其分析结果的相对相差应不大于20％。 5、其他 当称取谷物、坚果、油脂、调味品等样品5g时，方法检出限为１μｇ／kg定量限为３μｇ／kg。 当称取特殊膳食用食品样品5g时，方法检出限为0.1μｇ／kg，定量限为0.3μｇ／kg。