ELISA标曲异常原因+对策

ELISA实验中，标曲不仅能够帮助我们计算出样本浓度，还是指示实验人员操作手法是否规范的重要标志。在ELISA实验过程中，往往有标曲异常的情况出现，下面，远慕将介绍几种特殊情况，并将其原因与对策一一道来。1.整体偏低虽然标曲有一定梯度，但是最大OD值<1.2，梯度没有拉开。可能原因：1) 试剂盒过期或保存不当；2) 标准品未溶解完全；3) 加入终止液后，没有立即检测；4) 试剂盒部分试剂（特别是洗涤液）混用其他批次，或为混用外源溶剂。建议：1) 按照说明书保存各组分，在保质期内使用；2) 标准品溶解前，需要离心处理(10000×g离心1分钟)，加入1.0mL标准品&样品稀释液后，静置1-2分钟，用低速涡旋仪充分混匀；3) 加入终止液后，请立即进行检测。若需等待，放置在避光处的时间不宜超过10分钟；4) 使用试剂盒内一套完整的试剂，不要混用其他批次或外源溶剂。2.无信号标曲没有显色，OD值无梯度变化。可能原因：1) 试剂盒过期，或保存不当；2) HRP酶受到污染，导致活力和效价降低；3) 实验操作失误。例如：将生物素化抗体工作液和酶结合工作液的加样顺序颠倒；4) 订购多个指标，实验时混用标准品、酶标板、生物素化抗体等。建议：为了快速排查原因，请尝试混合10μL底物溶液和2μL浓缩HRP酶，观察是否发生颜色变化，并及时对显色结果拍照。如果有颜色变化（混用后呈现深蓝色/蓝绿色），表明HRP酶和TMB并无污染问题，可重新取一条板条，在避免以上问题的情况下制作标曲。3.整体偏高酶标仪仪器光密度范围过广，导致检测OD值范围也很高。建议光密度范围设置在0-3.5之间。可能原因：部分OD值超出仪器检测范围，可能是由于工作液浓度过高，或孵育时间过长/温度过高。建议：1) 按照说明书要求，在工作液使用前15分钟，将浓缩液于800×g离心1分钟，以浓缩液：稀释液=1：99的比例，现配现用；2) 孵育箱或烘箱需控制温度恒定37℃，温差不超过1℃，底物反应时间为15分钟左右。建议根据标准孔前4孔出现明显蓝色梯度，来控制实际显色时间，显色时间酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。4.全阳性可能原因：1) 竞争法按照夹心法操作；2) 洗涤不当：洗涤时每孔注入的洗液不够，或洗涤次数不够；液体过多溢出污染；浸泡时间过短；3) 显色剂保存不当，孵育时未避光，或试剂被污染等，造成非特异性显色。建议：1) 夹心法和竞争法原理不同，操作步骤不同，请注意区分；2) 按照说明书中洗涤操作进行洗涤；3) 避光保存底物溶液，使用前再拿出，避光孵育；各类试剂现用现拿，现配现用，注意枪头和加样槽的洁净，避免试剂污染。