高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中维生素A和E

本文参照新版国标《食品中维生素A和E的测定》（征求意见稿）建立了一种用于婴幼儿奶粉中维生素A和E测定的高效、稳定的液相色谱方法。方法验证表明该方法具有出色的回收率(>80%)和精密度 (RSD < 5%)，适用于婴幼儿奶粉中维生素A和E的定量分析。SSL-CA23-237 Excellence in ScienceLC-386 高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中维生 素A和E LC-386 摘要：本文使用岛津高效液相色谱仪开发并验证了一种高效、稳定的方法，用于分析婴幼儿配方奶粉中维生素A 和维生素E的5种异构体(a-生育酚、β-生育酚、y-生育酚、8-生育酚、α-生育三烯酚)。婴幼儿配方奶粉样 品进行皂化处理后，使用 SHIMSEN Styra HLB 柱进行净化后上机分析。结果表明：各组分在线性关系良好，重现 性好，回收率高，是用于测定脂溶性维生素的一种简便、低成本、高效且易于操作的技术。 关键词： HPLC婴幼儿奶粉维生素 技术特点： 心优化了前处理，过程更高效，回收率更高。 心 Shim-pack Velox PFPP具有背压低，柱效高的特点，对异构体具有更好的分离效果，无需柱温箱冷却(25℃)即可完成包括 VE 异构体的目标物分离。 脂溶性维生素A和E对人体健康发挥着重要作用：维生素A有促进生长、繁殖，维持骨骼、上皮组织、视力和粘膜上皮正常分泌等多种生理功能；维生素E 具有延缓衰老、抗氧化、预防多种慢性疾病等作用。因此在食品行业中，尤其是婴幼儿奶粉中添加维生素 A、E具有重要意义，但过量服用也会引发疾病。因此，出于安全考虑，准确定量婴幼儿配方奶粉中的维生素 A和E含量至关重要。 婴幼儿配方奶粉中添加的维生素A和E最常见形 式是视黄醇醋酸酯、视黄醇棕榈酸酯和a-生育酚醋酸 酯，样品可通过皂化反应将所有酯转化为醇，对其总 量进行测定。基于婴幼儿奶粉基质组成复杂，脂肪含 量高，维生素A和E的添加浓度较高，前处理通过固 相萃取小柱进行净化，采用配备紫外检测器的 HPLC 可以进行分析。 本文参照新版国标《食品中维生素A和E的测定》(征求意见稿)，并将前处理流程进行了改进，首先 对婴幼儿配方奶粉样品进行皂化反应，随后无需进行 提取，直接使用耐碱环境的 SHIMSEN Styra HLB萃取 小柱对皂化液进行净化，通过 HPLC-SPD 对维生素A 和E进行定量分析。结果表明，维生素A和维生素E 的异构体均有效分离，无杂质干扰，该方法快速、准确，可以很好地应对婴幼儿配方奶粉中维生素A和E定量 分析。 抗坏血酸和2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)均购自于 CNW， 氢氧化钾购自于阿拉丁。 维生素标准品及内标购置于天津阿尔塔科技有限公司，用乙醇配制。 表1 化合物信息 序号 中文名称 英文名称 CAS 分子式 分子量 1 维生素A Vitamin A 68-26-8 C20H300 286.45 2 D-a-生育酚 D-a-Tocopherol 59-02-9 C29H5002 430.71 3 D-B-生育酚 D-B-Tocopherol 16698-35-4 C28H4802 416.68 4 D-v-生育酚 D-y-Tocopherol 54-28-4 C28H4802 416.68 5 D-8-生育酚 D-8-Tocopherol 119-13-1 C27H4602 402.65 6 D-a-生育三烯醇 D-a-Tocotrienol 58864-81-6 C8HagO， 424.66 1.2仪器 本实验采用岛津高效液相色谱仪LC-40，具体配置为： 系统控制器：CBM-40自动进样器：SIL-40C 柱 温 箱：CTO-40C输 液 泵：LC-40D×2脱气机：LDGU-405检 测 器：SPD-M40 色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.118 1.3分析条件 色谱柱：SShim-pack Velox PFPP (250 mm x 4.6 mml.D.， 2.7um)，岛津(上海)实验器材有限公司， PN： 227-32023-04 流动相：AA相-水；B相-甲醇 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为80%，洗脱程序见表2 流速：11mL/min进样量：20 pL 柱温：335℃检测波长：维生素A 为 325 nm 维生素 E为294nm 表2 梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 2.00 泵 B.Conc 80 10.00 泵 B.Conc 85 20.00 泵 B.Conc 85 20.10 泵 B.Conc 95 23.00 泵 B.Conc 95 23.10 泵 B.Conc 80 27.00 Controller Stop 1.4标准品的配制 储备液的配制：用 EtOH(乙醇)配制100 ug/mL维生素A和E溶液(含1mg/mL BHT，防止标准品过快降解)。 混合标准系列工作溶液的配制：以50%甲醇为溶剂，进行混合标准储备液配置，维生素A浓度分别为0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、2、4、10 ug/mL， 维生素E浓度分别为：0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 ug/mL 的系列 标准溶液，待上机分析。 1.5样品前处理方法 婴幼儿配方奶粉购自本地超市。 图1展示了样品前处理流程，其主要包括：试样制备、皂化和 SPE 净化。试样制备过程中注意样品充分混合均匀，可使用温水(约40℃~50℃)加速溶解。抗坏血酸和 BHT的加入，主要为在样品前处理和检测过程中防止维生 素的降解。加入 EtOH是为了增加维生素溶解度，改善脂肪样品与 KOH溶液发生皂化反应的均匀性。皂化处理后，样品颜色由黄绿色变为棕红色。 SPE 净化采用 SHIMSEN Styra HLB(亲水亲酯共平衡小柱)进行，萃取小柱采用先进的亲水亲脂共平衡聚合物，对非极性化合物有较好的保留作用，对极性化合物也有一定的保留。即使在皂化反应的极强碱性条件下，该性能 仍然保持稳定。在样品清洗过程中，使用约10 mL水清洗萃取柱，并用甲醇/水(80/20)混合溶液洗去疏水性干 扰物。样品净化后，用于 HPLC分析。 图1 样品前处理流程图 ■结果与讨论 2.1色谱柱的选择 新版维生素A和E测定标准中采用的色谱柱类型为 C30 (150 mm x 4.6 mml.D.，3 um))，此类型色谱柱 可以有效分离维生素E异构体，检测过程中需注意：1、分析时间略长(>40 min)；2、柱温25℃，柱温高于 25℃会导致 D-B-生育酚、D-y-生育酚不能有效分离，所以液相设备需要采用制冷型柱温箱。 本方案采用了 Shim-pack Velox PFPP (250 mm x 4.6 mml.D.， 2.7 um) PN： 227-32023-04色谱柱，常规 柱温即可满足维生素E异构体的分离，且可以缩短分析时长。 2.2标准溶液色谱图 图2 VA (325 nm、2 ug/mL)、VE(294nm、10 ug/mL) HPLC 色谱图 图3 婴幼儿配方奶粉基质色谱图 注：1.维生素A；2.-a-生育三烯醇；3.D-8-生育酚；4.D-β-生育酚；5.D-y-生育酚；6.D-a-生育酚 2.3线性范围 按照1.4项下配制方法，配制校准曲线。。以化合物浓度X为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，5种组分线性良好，相关系数均大于0.995。以校准曲线浓度最低点使用10倍信噪比的方式计算检出限，定量限为 0.01~0.14ug/mL。 面积(x100，000) 面积(x100，000) 5.0 3.0- 2.5 0.0 0.0 5.0 浓度 面积(x100，000)5.02.50.00.0 25.0 浓度 维生素A D-B-生育酚 面积(x100，000) 5.0- 2.5- 0.0 0.0 0.0 25.0 浓度 0.0 25.0 浓度 面积(x100，000)5.0-2.50.0-0.0 25.0 浓度 D-v-生育酚 D-8-生育酚 D-a-生育三烯醇 图4 维生素A和E6种组分校准曲线 表3 维生素 AE 校准曲线 序号 化合物 线性范围(ug/mL) 准确度(%) 相关系数r 定量限(ug/mL) 1 维生素A 0.02~10 93.3~104.8 0.9990 0.01 2 D-a-生育酚 0.2~50 93.1~105.4 0.9999 0.14 3 D-B-生育酚 0.2~50 88.8~105.3 0.9998 0.07 4 D-v-生育酚 0.2~50 91.6~105.5 0.9997 0.06 5 D-8-生育酚 0.2~50 89.0~104.0 0.9998 0.05 6 D-a-生育三烯醇 0.2~50 98.9~101.1 0.9999 0.05 2.4重复性 对混合标准溶液连续分析6次，计算重复性。结果见表4。结果表明：各组分保留时间的 RSD% 在 0.03%-0.06%之间，峰面积的 RSD%在1.68%-3.91%之间，方法重复性良好，仪器精密度良好。 表4 重复性结果果(n=6) 序号 化合物 浓度(ug/mL) 保留时间 RSD% 峰面积 RSD% 1 维生素A 0.1 0.03 1.68 2 D-a-生育酚 0.5 0.06 3.91 3 D-B-生育酚 0.5 0.06 3.78 4 D-y-生育酚 0.5 0.06 2.91 5 D-8-生育酚 0.5 0.05 1.88 6 D-a-生育三烯醇 0.5 0.03 3.62 2.5方法准确性和精密度 取某婴幼儿品牌奶粉，按照1.5前处理方式进行处理，对实际样品进行测试，以评估准确度，结果如表5所示。向样品中添加一定浓度的目标物，制备出两个水平的加标样品，每个水平重复3次，进行加标回收率和精密 度试验。表5为实验结果，平均回收率为 83.0%~108.4%，相对标准偏差为0.36%~3.38%。 表5奶粉样品加标实验结果(n=6) NO. 化合物名称 样品浓度 (mg/100g) 加标1 加标2 加标量 (mg/100g) 回收率% RSD% 加标量 (mg/100g) 回收率% RSD% 1 维生素A 0.77 1.0 96.5 0.36 2.0 89.7 0.84 2 D-a-生育酚 14.86 10.0 108.4 1.18 20.0 83.0 1.78 3 D-B-生育酚 0.23 10.0 100.1 3.38 20.0 90.5 1.64 4 D-y-生育酚 2.60 一一 一一 一一 一一 5 D-8-生育酚 0.24 一 6 D-a-生育三烯醇 N.D. 10.0 101.8 1.68 20.0 86.4 0.56 注：1、加标1中加标浓度根据奶粉基质中标识的浓度进行添加，加标2中为奶粉基质中标识浓度的两倍。 2、 “N.D.”表示未检出； “”表示加标实验中未添加该目标物。 结论 本文参照新版国标《食品中维生素A和E的测定》 (征求意见稿)建立了一种用于婴幼儿奶粉中维生素A 和E测定的高效、稳定的液相色谱方法。方法验证表明该方法具有出色的回收率(>80%)和精密度 (RSD<5%)，适用于婴幼儿奶粉中维生素A和E的定量分析。 岛津应用云