LC-MS/MS法测定土壤中四环素类抗生素的含量

本文利用岛津公司的LCMS-8050三重四极杆液质联用仪，参照DB 13/T 5221-2020 《土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定 高效液相色谱-串联质谱法》，建立了土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定方法。本方法灵敏度较高、重现性较好，能有效检测土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素含量。SSL-CA23-173Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-778 LC-MS/MS 法测定土壤中四环素类抗生素 的含量 LCMSMS-778 摘要：本文利用岛津三 重 四极杆液质联用仪，建立了一种土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉 素的测定方法 。结果表明，5种抗生素各组分线性关系良好，土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素检 测 限为 0.25 ug/kg， 定量限为1 ug/kg(远低于标准要求的检 测 限 2.5 ug/kg， 定量限10 ug/kg)。标准溶液重 复进样6针，保留时间和 峰 面积重复性良好。加标回收实验中，各组分回收及精密度良好，可满足 检 测要求。 关键词：三重四极杆液质联用仪 四环素类抗生素 土壤 技术特点： 小 可 应对 DB 13/T 5221-2020《土 壤中 土 霉素 、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定高效液相色谱 -串联质谱法》。 小检出限和定量限均优于标准要求。 土霉素、四环素、金霉素、美他霉素和多西环素 统称为四环素类抗生素。此类抗生素常用作兽药，广泛 应用 于 畜禽养殖业。过量四环素类抗 生 素会伴随畜禽代 谢产物累积在土壤中，严重破坏生态系统。因此对土壤 中的抗生素进行监测 是 必要的。 本法采用 Na，EDTA-M e llvaine缓冲溶液+乙腈 (7：3) 进行超声、振荡提取，经净化及过滤后上机测定，具有 高精度，高效率，重 现性好等特点。 本文利用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050，通过液体超声、振荡提取法，建立 了 土壤中的5种四环素类抗生素的检测方法，供检测人员参考。 实验部分 1.1仪器配置 本文使用岛津LCMS-8050 三 重四极杆液质联用仪，配置信息如 下 ： 系统控制器：CBM-20A 脱 气 机 号 ：DGU-20A 5R 输 俞 液泵 泵：：LC-30AD×2自动进样器 许：SIL -30AC 柱温箱 自：CTO-20AC 质谱检测器：LCMS -8050 色谱工作站：：LabSolutions Ver . 6.102 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱 柱： XBridge BEH C18， (3 mm x 100 mml.D.， 2.5 um)流动 流 柱 相 目： A 相-0.1%甲酸水；B相 -乙腈 速： 0.5 mL/min 进 样 量： 10pL 温 ：35℃ 洗脱兑7方方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为20%，详见表1。 表 1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 5.00 泵 B.Conc 30 5.10 泵 B.Conc 60 8.00 泵 B.Conc 60 8.10 泵 B.Conc 20 10.00 泵 B.Conc 20 10.00 控制器 Stop 质谱条件： 离 源：ESI(+)接 口电压：4.5kV 3 L/min 加热模块温度：400°℃加热气流速：：10.0L/minDL温 度：250℃干燥气流速：10.0 L/min 接口 度：3300°℃ 扫描模式： 多反应监 测 (MRM) MRM 参 数：详见表2 表2抗生素 MRM 参数 NO. 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1PreBias(V) CE(V) Q3PreBias(V) 1 土霉素 461.0 426.0* -13.0 -19.0 -16.0 443.0 -17.0 -13.0 -23.0 2 四环素 445.0 410.0* -10.0 -20.0 -21.0 427.0 -17.0 -13.0 -22.0 3 金霉素 479.0 444.0* -11.0 -21.0 -17.0 462.0 -11.0 -18.0 -24.0 4 美他霉素 443.0 426.0* -17.0 -17.0 -22.0 381.0 -17.0 -24.0 -28.0 5 多西环素 445.0 428.0* -17.0 -19.0 -21.0 154.0 -10.0 -28.0 -17.0 注：*表 示 定 量离 子 1.3标准溶液的配置 1.3.1标准储备液(100ug/mL) 准确称取土霉素、四环素、金霉素、美他霉素和多西环素各10.0 mg，分别用 甲 醇溶解并定容至100 mL， 4℃保存 于 密封棕色瓶中。 1.3.2混合标准中间液(1000ng/mL) 准确吸取各标准储备液(1.3.1)1 mL于100mL容量瓶 中 ，用 甲 醇定容至刻度，摇匀，4℃保存于密封棕色瓶 中 。 1.3.3混合标准使用液 准确吸取混合标准使用液(1.3.2)适量，，于 6个100mL容量瓶中，用乙腈：0.1%甲酸水(2：8)定容，此 标准系列中各抗生素的浓度分别为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 。 1.4样品前处理 参照 DB 13/T 5221-2020《土壤中土 霉 素 、金 霉 素、四环素 、多西环素、美他霉素的测定高效液相色谱 -串联质谱法》。 图1 前 处 理流程图 ■ 2.1标准溶液色谱图 表35种 抗 生素信息 NO. 中文名称 英文名称 CAS 号 保留时间(min) 1 土霉素 Oxytetracycline 6153-64-6 1.579 2 四环素 Tetracycline 60-54-8 1.875 3 金霉素 chlortetracycline 57-62-5 3.234 4 美他霉素 methacycline 914-00-1 3.444 5 多西环素 doxycycline 564-25-0 3.790 5种抗生素的标准溶液 MRM 色谱图如图2所示，相关化合物信息见表3。 图25种抗生素标准溶液 MRM 色 谱 图 2.2线性范围、检测限和定量限 按照1.3配制成各浓度标准溶液，以各目标物浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，以外标法绘制标准曲 线，所得校准曲线线性关系良好，线性相关系数大于 0.999。曲线结果如下图3所示。线性方程及相关系数如 下表4所示。 图3化 合 物校准曲线 表4材 校准曲线参数 NO. 化合物名称 线性范围 (ng/mL) 相关系数(r) 准确度 (%) 检测限 (ug/kg) 定量限 (ug/kg) 1 土霉素 1.0~50.0 0.9998 92.1-102.9 0.25 1.0 2 四环素 1.0~50.0 0.9997 91.1-105.0 0.25 1.0 3 金霉素 1.0~50.0 0.9998 97.2-107.7 0.25 1.0 4 美他霉素 1.0~50.0 0.9998 92.1-102.9 0.25 1.0 5 多西环素 1.0~50.0 0.9999 96.6-105.1 0.25 1.0 2.3重复性考察 配制浓度为 1 ng/mL标准溶液，连续进样6次，考察分析方法保留时 间 和峰面积的重复性。结果表明 ：保 留时间的 RSD% 均小于1.0%；峰面积的RSD%均小于10.0%，方法重 复 性良好，仪器精密度良好。结果见表5。 表5 重 复性测试(n =6) NO. 化合物名称 峰面积 RSD(%) 保留时间 RSD (%) 1 土霉素 2.40 0.12 2 四环素 1.92 0.06 3 金霉素 4.86 0.07 4 美他霉素 1.39 0.05 5 多西环素 2.06 0.04 2.4加标回收实验 按照1.4步骤中制备样品和加标样品，三个水平加标浓度如下表6所示。结果显示：各水平的加标平均回收 率在 85.2~101.3%之间，相对标准偏差 RSD%在1.17~3.74% 之间。 表6样品加标实验结果(n =6) NO. 化合物名称 样品量 (ng/mL) 0.25 ug/kg 1pg/kg 5 ug/kg 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% 1 土霉素 N.D. 97.7 1.61 85.2 2.17 89.4 3.06 2 四环素 N.D. 99.8 2.51 92.3 1.57 94.6 1.17 3 金霉素 N.D. 101.3 2.64 99.0 3.74 99.4 1.39 4 美他霉素 N.D. 93.4 4.19 92.3 1.49 95.5 2.71 5 多西环素 N.D. 92.2 2.46 90.1 2.35 89.4 2.93 N.D.：表 示 未检出。 结论 本文利用岛津公司的 LCMS-8050三 重四 极杆液质联用仪，参照 DB 13/T 5221-2020《土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定高效液相色谱-串联质谱法》，建立了土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的 测 定方法。本方法灵敏度较高、重现性较好，能有效检测土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素含量。 岛津应用云