二氧化碳培养箱做破骨细胞的传代、冻存与复苏

一、实验动物：成年SPF级雄性SD大鼠1只， 体重250g。二、实验方法及步骤1、外周血单个核细胞分离（1）标本采集：取SPF 成年 SD 大鼠 1 只，3％戊巴比妥钠，按动物体重0.15 ml/100g，腹腔注射麻醉。无菌操作下腹主动脉采血6 ml，注入肝素抗凝管中。（2）单个核细胞分离：采用密度梯度离心法， 向采集的血样标本内加入等量的PBS，取4支15ml离心管，分别加入大鼠淋巴细胞分离液各3ml，再缓缓向各离心管内加入上述含PBS血样各3ml，然后以2000r／min，水平离心20min，取出后在絮状层小心吸取单个核细胞，分别收集到2支离心管中，PBS清洗2次，备作重悬培养。2、破骨细胞的诱导培养将分离纯化的大鼠周围血单个核细胞，用含10％FBS、50ng／mlRANKL、20ng ／mlM－CSF、100U／ml青霉素、100U／ml链霉素的 α－MEM培养液重悬，调整细胞密度为1×105个／ml。再将配制好的细胞悬液接种到6孔培养板与直径35 mm培养皿中。直径35mm培养皿用于活细胞工作站动态跟踪成像，6孔培养板置 于二氧化碳培养箱内，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下连续培养，用上述含RANKL、M－CSF的α-MEM 培养液换液，每3日1次。同时对整个培养过程作相差显微镜观察与活细胞成像，培养14 d作抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。3、破骨细胞的传代大鼠周围血单个核细胞经RANKL、M－CSF 诱导培养2周，形成大量贴壁的多核破骨细胞后，从二氧化碳培养箱中取出，将培养液吸净，加入37 ℃预温的D－Hank＇s液，冲洗2次，再滴加足0.25％胰蛋白酶液，使其覆盖整个底面，置于37 ℃培养箱中消化5min后取出，震荡1min左右，在倒置相差显微镜下观察，当大部分细胞收缩悬起后，加入α－MEM完全培养液终止消化，用吸管反复抽吸吹打，将细胞混匀后移入15ml离心管，2000r／min，离心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF的α－MEM完全培养液重悬细胞， 调整浓度至1×105个／ml，接种细胞至6孔培养板与直径35mm 培养皿中。同时对消化与贴壁过程作活细胞成像观察，3d后作TRAP染色。4、破骨细胞的冻存按破骨细胞传代方法，将诱导培养的破骨细胞制成细胞悬液，2000r／min，离心5min，去上清，用DMSO、FBS、α－MEM 按1∶2∶7 比例配制的冻存液，重悬细胞，调整细胞浓度至5×106个／ml，加入冻存管，每支1.5ml，用冻存罐在温度为－80℃冰箱中放置24h，再移至－196 ℃液氮中冻存。5、破骨细胞的复苏从液氮中取出冻存的破骨细胞，迅速在 37 ℃水浴中震荡融解，将融解的细胞悬液加入15ml离心管中，再加6ml α－MEM完全培养液，混匀，2000r／min，离心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF 的α －MEM完全培养液，按1×105个／ ml的细胞浓度重悬后，分别接种到6孔培养板与直径35mm培养皿中。同时对接种后的贴壁过程作活细胞成像观察，3d后作TRAP染色。色，取出后去离子水冲洗，晾干，倒置显微镜下观察，DP-72 数字成像系统采集图像。技术参数上海喆图科学仪器有限公司 用途概 述 ZCP系列 二氧 化 碳培养箱是通过在 培 养 箱 箱 体 内 模拟 形成类似细胞/组织 在 生 物 体内的生长 环境 ，要求稳定的温度37℃、稳定的CO2水平5%、恒 定的 酸 碱度 (pH 值： 7.2-7.4)、较高的相对饱和湿度 (95%)来对细胞/组织进 行体 外培养的 一 种仪 器。二 氧 化碳培养箱是开 展免 疫学、肿 瘤 学 、遗 传学 及生物工程所必需的关键设备，广泛 应 用 于 细胞、组织培养和某些特殊微生物的培养 ，常见 于 细胞动力 学 研 究、哺乳动物细胞分 泌物 的收集、各 种 物 理、化学因 素 的致癌或毒理效应、抗原的 研 究 和 生产、培 养杂 交 瘤细胞生产抗体、体外授精(IVF)、干 细 胞、组 织 工程 、药物筛选 等 研 究领 域 。 产 品特 点 ※可 上下堆叠放置 二层，便 于 实 验室 空 间 的充分利用 ，可更改 开 门方向； ※进 气 口配备 高 效空 气 过滤器，针 对 粒 径 ≥0.3u m 粒子期 过 滤效率 高 达 99.99%； ※采 用 镜面不锈钢 内 胆，四 角 半 圆 弧 过 渡 设 计 ，搁板支架可以自 由 装 卸，易于清洁；※防倾斜搁板的设计，使 搁板抽 出 一半时仍能保 持 水 平 状态 ，可 有 效防止培养液溢出； ※箱内 标 配 加 湿水盘，湿度 蒸发面积大，易达到相对饱 和 湿度，开关门 后 湿度恢复快 ； ※一 机两用 ，可通过打 开 或 者关 闭C O2浓度控制 ，做二 氧 化碳培养箱 或 恒温培养箱使 用 ；※采 用 门加热控制系统，可有效避免内玻璃门结露现象，以防止其 带 来微生物 污 染 的 可能性； ※可 设 定温度值的单 位 为摄氏度℃或华 氏 度 P ，设定后有摄氏度℃或华氏度 F指 示 灯 亮做 提 醒； ※水 套式箱内水位过 低 时，水位控制器自 动 报 警，同 时 切 断 加 热输出 ，防 止 机 器出现 干 烧 情 况； ※陶瓷 纤 维保温材料使其 具 备良好的绝热性能和密封性能来 确 保二 氧 化碳培 养 箱完美的热稳定 性 ； ※具有浓 度 自整定功能，如果温 度 或者CO 2浓 度 控制不理想，可 启 动温度或者CO2浓度自整 定 功能； ※具有多种查询 功 能，可依次查看 门 温温度，环境温度，紫外 灯 已 经工作的时间以及剩余的工作周期 ； ※当 设 备加热时加 热 指示 灯 亮，加热渐 出功 率 可数字显示并自 动 变频调整加 热 功 率 百分比，智 能节能 ； ※具 有门控功能，门 控触点闭 合 为 开 门 ，断开 为 关门 ，当开 门 时，自动关断 所 有输 出 ，蜂 鸣 器会自动 报 警； ※加热异常温度 偏 高偏低、CO2浓度偏离设定值、CO2气体用完或CO2传感器有异 常 均会 有 错误提醒标志； ※内置无 臭 氧型紫外 杀 菌 灯 可 杀 灭箱体内循环 空 气及 加 湿盘水气中的浮菌，有 效防 止 细胞 培 养期 间 的污染 ；※具 有多种提醒 功 能 ，有 预 约 时 间开启时 预 约指示灯 亮、风机运转 时 风机指示灯 亮、停机 或 者有异常时 报 警 指示灯闪烁、缺水时 水 位报警灯 亮 、当键盘锁定 时 锁定键盘灯 亮 、当 控 制器设定 为 程 序控 制 时 程 序 指 示灯 亮 ； ●红 外传感器 ※具 有自动温度 补 偿 、内 置 大气和零点校准功能、零点漂移及满量 程 漂 移补偿，浓 度 测量精确通，响 应 速度 <20S ，无 氧气依赖性 和 催 化 传感器的中毒现象，寿 命 长 ，准确度高，抗 干 扰性 强，电源和输 出 有过 压和 反 接保护，安全可靠 。※CO2浓度的监测不 受 温度和湿度的影 响 ，在 实验过程中 需 频繁打开箱 门 时 ，可快速 恢 复温度及浓度值，如开 门 30秒 后关门 ，可3分钟内恢复到37℃，10分钟 内 恢复到5%CO2浓度 。 ●紫外杀菌系统 ※紫外 灯 杀菌工作时紫外 灯 指示灯亮，紫外杀 菌灯 可设置常 开 或定时 ，根据设定时间间隔自动开启杀 菌 灯 ； ※消毒 过 程中 门 开 启 则自动停止 消 毒，门 闭合自动 启 动消毒，紫外灯打开 时 间可记录，超 过 规定值自动提示更换紫 外 灯。气 套 式 和 水 套 式两 款都是准确和 可 靠 的 ，主 要 区别 在于 ： ●气 套 式加 热 气套式加热是通过遍布箱体气套 层 内的加热器直 接 对内箱体进行加热的 。 优 点 ：电 加热加热速度 快 ，温度恢复比水套式 培 养 箱 更迅速，特别 有利 于短期培养以及箱 门 频 繁 开 关取放样的试验 。 ●水 套式加 热 是 通过 一 个独立的 水 套层包围内部的 箱 体来维持温度恒定的，通过加热隔层内的 水 ，水 的热 量 通过辐射再 传递到箱体 内 部 从而 保 持了温度的恒定 。 三 优 点 ：水 是 一种很好的绝热物质 ，当 遇 到断 电 的时候 ，水 套式系统就可 以 比较长 时 间的保持培养箱内的温度均 匀 性 以 及 准确性和稳定性 ，有 利于实 验 环 境不 稳定(如对实验有用电限制或 经常 停电 )的用 户 选用。 可选配件 二 氧 化碳 减 压阀- 一￥600 自然加湿湿度 显 示系统 - ￥3000 独 立 限温控制器- ￥600 微 型打印 机 (嵌入式打印机 ) ·二 一 -￥1500 R S485接口及通讯软件 一 ￥600 无线 短 信 报警系统 (不 含 手机及SIM卡 ) -￥2500 零 型号 ZCP-Q50 ZCY-50W ZCP-Q80 ZCP-80W ZCP-Q160ZCP-160W ZCP-Q270ZCP-270W ZCP-Q50T ZCP-50WT ZCP-Q80T ZCP-80WT ZCP-Q160TZCP-160WT ZCP-Q270TZCP-270WT 电源电压 AC220V 50Hz AC220V 50Hz 控温范围 RT(室温)+5~60℃ RT(室温)+5~60℃ CO2控制范围 气套式(液晶显示屏) 气套式(彩色触摸屏) 加热方式 远红外传感器 远红外传感器 恒温波动度 ±0.2℃ ±0.2℃ 温度分辨率 0.1℃ 0.1℃ CO2控制精度 ±0.1%vol ±0.1%vol CO2控制范围 0~20% 0~20% 加热恢复时间 开门30s恢复到37℃<5min 开门30s恢复到37℃<5min 高效过滤器 针对粒径≥0.3um粒子，过滤效率高达99.99% 针对粒径≥0.3um粒子，过滤效率高达99.99% 灭菌方式 UV紫外杀菌(可按时间间隔定时开启) UV紫外杀菌系统(可按时间间隔定时开启) 加湿方式 自然蒸发≥95%RH(可选配数字显示湿度功能) 自然蒸发≥95%RH(可选配数字显示湿度功能) 输入功率 250W 350W 550W 700W 250W 350W 550W 700W 内胆尺寸W*D*H(mm) 345*350*410 400*400*500 500*500*650 600*600*750 345*350*410 400*400*500 500*500*650 600*600*750 外形尺寸W*D*H(mm) 545*465*710 550*525*800 650*620*950 750*715*1030 545*465*710 550*525*800 650*620*950 750*715*1030 公称容积 50L 80L 160L 270L 50L 80L 160L 270L 载物托架 2块 2块 型号 ZCP-Q50RZCP-50WR ZCP-Q80RZCP-80WR ZCP-Q160RZCP-160WR ZCP-Q270RZCP-270WR ZCP-50TR ZCP-50WTR ZCP-80TR ZCP-80WTR ZCP-160TRZCP-160WTR ZCP-270TRZCP-270WTR 电源电压 AC220V 50Hz AC220V 50Hz 控温范围 4-60℃(带制冷) 4-60℃(带制冷) CO2控制范围 水套式(液晶显示屏) 水套式(彩色触摸屏) 加热方式 远红外传感器 远红外传感器 恒温波动度 ±0.1℃ ±0.1℃ 温度分辨率 0.1℃ 0.1℃ CO2控制精度 ±0.1%vol ±0.1%vol CO2控制范围 0~20% 0~20% 加热恢复时间 开门30s恢复到37℃<8min 开门30s恢复到37℃<8min 高效过滤器 针对粒径≥0.3um粒子， 过滤效率高达99.99% 针对粒径≥0.3um粒子， 过滤效率高达99.99% 灭菌方式 UV紫外杀菌(可按时间间隔定时开启) UV紫外杀菌(可按时间间隔定时开启) 加湿方式 自然蒸发≥95%RH(可选配数字显示湿度功能) 自然蒸发≥95%RH(可选配数字显示湿度功能) 输入功率 250W 350W 550W 700W 250W 350W 550W 700W 内胆尺寸W*D*H(mm) 345*350*410 400*400*500 500*500*650 600*600*750 345*350*410 400*400*500 500*500*650 600*600*750 公称容积 50L 80L 160L 270L 50L 80L 160L 270L 载物托架 2块 2块