利用LUMiSizer®评估羧甲基魔芋葡甘露聚糖对豌豆蛋白水分散液的稳定性影响

利用LUMiSizer®评估羧甲基魔芋葡甘露聚糖对豌豆蛋白水分散液的稳定性影响近年来，消费者对中性与酸性植物蛋白饮料的需求不断增加。豌豆蛋白作为一种植物来源的天然可持续性蛋白质，是代替动物蛋白用于食品配方的可靠原料之一。然而，豌豆蛋白因表面疏水性强且电荷量低，导致其在水中的溶解度低、物理稳定性差。尤其在酸性条件下，当体系pH值接近蛋白质等电点时，豌豆蛋白易发生聚集，使体系稳定性进一步大幅降低，因此豌豆蛋白在酸性蛋白饮料中的应用受到很大限制。天然生物大分子多糖与蛋白质相互作用，可以阻止或减缓蛋白质的聚集和沉降，提高蛋白分散液的物理稳定性。多糖对蛋白分散液体系的稳定主要有2 种作用机制：一是在酸性条件下，聚阴离子多糖，如果胶、羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）或大豆可溶性多糖，可与带正电荷的蛋白颗粒形成静电复合物，通过静电排斥和空间位阻保持蛋白质分散液的稳定性。这些多糖与酪蛋白胶束发生静电吸附，在蛋白胶束表面形成了刷状或环状吸附结构，从而阻止了蛋白胶束的酸诱导聚集使体系稳定。二是，添加的多糖在体系中形成高分子物理缠结网络，增加了连续相的黏度，从而阻碍和迟滞了蛋白颗粒的聚集和沉降。近期对魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）、 CMC 和玉米纤维胶以及羧甲基改性的玉米纤维胶（carboxymethylated corn fiber gum，CMCFG）提高豌豆蛋白分散液（pea protein dispersion，PPD）稳定性的能力进行比较研究发现，KGM的添加可通过增黏作用实现PPD在中性和酸性（pH 3.5）条件下的物理稳定，羧甲基化的CMC和CMCFG则通过与豌豆蛋白的静电吸附促成了体系的稳定。1 材料和方法KGM 湖北一致魔芋生物科技股份有限公司； NUTRALYS® S85F豌豆分离蛋白（纯度85%） 法国罗盖特公司；盐酸和柠檬酸等化学试剂均为国产分析纯；超纯水为实验室自制；CMKGM为基于已知方法，制备7 种不同分子质量和不同取代度的样品。2 仪器与设备ME204/02电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MZ3004磁力搅拌器 上海志威电器有限公司；Milli-Q Plus超纯水系统美国Millipore公司； HAAKE MARSIII旋转流变仪 美国Thermo Fisher公司； 高压均质机 美国NanoDeBEE公司；LUMiSizer稳定性分析仪 德国LUM GmbH公司；Zetasizer Nano-ZS90粒径分析仪 英国马尔文仪器公司。3 方法PPD的制备称取一定量的豌豆分离蛋白分散于超纯水中，在室温下搅拌1 h，并用高压均质机在50 MPa下循环均质7 次，获得质量分数1%的PPD。将CMKGM样品溶于超纯水中，配制不同质量分数的多糖溶液，然后将1% PPD与多糖溶液以1∶1的质量比混合后搅拌1 h，采用500 g/kg的柠檬酸调节pH值至3.5，继续搅拌1 h，获得多糖稳定的蛋白分散液。不稳定指数测试 采用稳定性分析仪对新鲜制备的PPD-多糖复合物（中性和p H 3.5）进行稳定性测试。测试条件：转速3 000 r/min，光源865 n m，测试时长1.0 h，温度25 ℃。4 结果与讨论质量分数一定条件下不同CMKGM对PPD体系的稳定效果比较。A.空白；B. KGM；C. CMKGM-1；D. CMKGM-2； E. CMKGM-3；F. CMKGM-4；G. CMKGM-5；H. CMKGM-6；I. CMKGM-7；下标1. pH 7.0；下标2. pH 3.5。 图 1 中性和pH 3.5条件下质量分数1%的KGM和CMKGM的 1% PPD的透过率变化如图1所示，在透射曲线上，红线表示样品初始状态的透过率，绿线代表测试进行过程中样品的透过率。在离心过程中，密度大的分散相逐渐迁移到样品管底部，从而使上清液部分的透过率增加。通过透射曲线的变化可以反映出分散液的稳定性。一般而言，在离心过程中，透过率变化越大，样品越不稳定。基于透射曲线还能获得样品的不稳定指数，可定量表征不同样品稳定性的大小（图2）。不稳定指数的数值介于0～1之间，其中0表示体系非常稳定，而1代表体系非常不稳定。在稳定性评估中，以不稳定指数达到0.2或以下为稳定标准。由图1、2可知，在不添加稳定剂的情况下，PPD在中性和pH 3.5下均不稳定，且酸性条件下的不稳定程度远大于中性条件。这是由于豌豆蛋白在水中的溶解度低，在离心过程中容易发生聚集，特别是当pH值降低，接近豌豆蛋白等电点（～pH 4.5）时，蛋白颗粒之间的静电斥力减弱，更加剧了蛋白胶束的聚集和沉降。多糖的添加在很大程度上改善了体系的稳定性。仅质量分数1%的中性KGM，PPD在中性和酸性条件下都能表现出良好的稳定性。由于不产生有效吸附，这主要是由于KGM的增黏作用。在中性条件下，当添加1%的具有不同取代度和不同分子质量的CMKGM样品时，仅有CMKGM-1能够有效稳定PPD，其他样品（CMKGM-2～CMKGM-7）均不能起到稳定作用。由于在中性条件下，豌豆蛋白颗粒和多糖分子均带负电荷，多糖的稳定作用主要来源于其增黏作用，然而对于CMKGM-2～CMKGM-7样品，由于分子质量逐渐降低，在相同质量分数下（1%）不能起到有效的增黏作用，故不能稳定PPD。在pH 3.5条件下，CMKGM-1、CMKGM-2和CMKGM-3均能在一定程度上保持PPD的稳定，这是因为在酸性条件下豌豆蛋白带正电，带负电的CMKGM能够与豌豆蛋白发生静电吸附使PPD-多糖复合物带负电，从而通过静电排斥作用和空间位阻作用阻碍蛋白颗粒的聚集。再加上未吸附多余多糖分子的增黏作用，两者共同维持了PPD体系的稳定。然而，尽管CMKGM-4～CMKGM-7这4 个样品的羧甲基的取代度增加有利于发挥其在酸性条件下稳定PPD体系中的静电排斥作用，但是由于分子质量过低导致增黏作用大幅减弱，使这些样品在质量分数1%的条件下不能稳定酸性PPD体系。利用 LUMiSizer@评估羧甲基魔芋葡甘露聚糖对豌豆蛋白水分散液的稳定性影响 近年来，消费者对中性与酸性植物蛋白饮料的需求不断增加。豌豆蛋白作为一种植物来 源的天然可持续性蛋白质，是代替动物蛋白用于食品配方的可靠原料之 一 。然而，豌豆蛋白 因表面疏水性强且电荷量低，导致其在水中的溶解度低、物理稳定性差。尤其在酸性条件下，当体系 pH 值接近蛋白质等电点时，豌豆蛋白易发生聚集，使体系稳定性进一步大幅降低，因此豌豆蛋白在酸性蛋白饮料中的应用受到很大限制。 天然生物大分子多糖与蛋白质相互作用，可以阻止或减缓蛋白质的聚集和沉降，提高蛋 白分散液的物理稳定性。多糖对蛋白分散液体系的稳定主要有2种作用机制：一是在酸性 条件下，聚阴离子多糖，如果胶、羧甲基纤维素 (carboxymethy l cellulose， CMC) 或大豆 可溶性多糖，可与带正电荷的蛋白颗粒形成静电复合物，通过静电排斥和空间位阻保持蛋白 质分散液的稳定性。这些多糖与酪蛋白胶束发生静电吸附，在蛋白胶束表面形成了刷状或环 状吸附结构，从而阻止了蛋白胶束的酸诱导聚集使体系稳定。二 是，添加的多糖在体系中形 成高分子物理缠结网络，增加了连续相的黏度，从而阻碍和迟滞了蛋白颗粒的聚集和沉降 近期对魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan， KGM)、(CMC 和玉米纤维胶以及羧甲基 改性的玉米纤维胶 (carboxymethylated corn fiber gum， CMCFG)提高豌豆蛋白分散液(pea protein dispersion， PPD) 稳定性的能力进行比较研究发现， KGM 的添加可通过增黏作用 实现 PPD 在中性和酸性(pH3.5)条件下的物理稳定，羧甲基化的 CMC 和 CMCFG 则通过与豌 豆蛋白的静电吸附促成了体系的稳定。 1材料和方法 KGM 湖北 一 致魔芋生物科技股份有限公司；；NUTRALYS@ S85F 豌豆分离蛋白(纯度85%)法国罗盖特公司；盐酸和柠檬酸等化学试剂均为国产分析纯；超纯水为实验室自制； CMKGM 为基于已知方法，制备7种不同分子质量和不同取代度的样品。 表1 不同取代度的CMKGM样品信息 Table 1 Information about CMKGM with different degrees of substitution 样品 取代度 分子质量/(10'Da) 特性黏度/(dL/g) KGM 0 7.88 14.69 CMKGM-1 0.19 7.33 10.68 CMKGM-2 0.27 6.54 8.28 CMKGM-3 0.34 6.01 6.13 CMKGM-4 0.63 3.81 4.56 CMKGM-5 1.00 2.24 2.12 CMKGM-6 1.26 1.63 1.75 CMKGM-7 1.63 1.57 1.57 2仪器与设备 ME204/02电子 天平 梅特勒-托 利 多仪器(上 海 )有限公司；M Z3004磁力搅拌器上 海 志 威电 器 有限公 司 ； Milli -Q Pl u s超纯水系统 美 国 Millipore 公 司 ； HAAKE MARSIII 旋转流 变仪 美 国 Thermo Fisher 公 司 ； 高 压均质机 美国 N anoDeBEE 公 司 ； LU M iSizer 稳定性分 析仪德 国 LUM GmbH公 司 ； Z e tasize r N ano -ZS90粒径分析仪 英 国 马尔文仪器公 司。 3方法 PPD 的制备 称取一定 量 的 豌 豆 分 离 蛋白分散于超纯水中，在室 温下搅拌1h，并 用 高 压均质机 在 50MPa 下循环均质7次，获 得质 量 分数1%的 PPD 。将 C M KGM 样品溶于超纯水中，配制不 同 质 量 分数的多 糖 溶液，然后将 1% PPD 与 多糖溶液以1：1的质 量 比 混 合后 搅 拌1h， 采 用 500 g /kg 的柠檬 酸 调节 pH 值至3.5，继 续 搅拌1h， 获得 多 糖稳定 的 蛋 白 分散液。 不稳 定指数测试 采用 稳 定 性分析仪对 新 鲜制备的 PPD-多 糖 复 合 物 (中 性和pH 3.5)进行 稳 定性 测 试。测 试条件：转速3 000 r /min， 光源865n m， 测试时长1.0h，温 度25℃。 4结果与讨论 质 量 分数 一 定条件下 不 同 CMKGM 对 PPD 体系 的 稳定效果比较。 A. 空白； B. KGM； C. CMKGM-1；D. CMKGM-2； E. CMKGM -3；F. CMKGM-4；G. CMKGM-5；H. CMKGM-6；I . CMKGM-7：下标1. pH 7.0； 下标2. pH 3.5。 图1中性和pH 3.5条件下质量分数1%的KGM 和 CMKGM 的 1% PPD 的透过率变化 样 品 图2 中性和pH3.5条件下质量分数1%的KGM和CMKGM的 1%PPD的不稳定指数 如图1所示，在透射曲线上，红线 表示样品初始状态的透过率，绿线代表 测试进行过程中样品的透过率。在离心 过程中，密度大的分散相逐渐迁移到样 品管底部，从而使上清液部分的透过率 增加。通过透射曲线的变化可以反映出 分散液的稳定性。一般而言，在离心过 程中，透过率变化越大，样品越不稳定。 基于透射曲线还能获得样品的不稳定指数，可定量表征不同样品稳定性的大小(图2)。不 稳定指数的数值介于0~1之间，其中0表示体系非常稳定，而1代表体系非常不稳定。在 稳定性评估中，以不稳定指数达到0.2或以下为稳定标准。 由图1、2可知，在不添加稳定剂的情况下， PPD 在中性和 pH 3.5下均不稳定，且酸性 条件下的不稳定程度远大于中性条件 。这是由于豌豆蛋白在水中的溶解度低，在离心过程中 容易发生聚集，特别是当 pH 值降低，接近豌豆蛋 白 等电点(~pH4.5)时，蛋白颗粒之间 的静电斥力减弱，更加剧了蛋 白 胶束的聚集和沉降。多糖的添加在很大程度上改善了体系的 稳定性。仅质量分数1%的中性 KGM， PPD 在中性和酸性条件下都能表现出良好的稳定性。由 于不产生有效吸附，这主要是由于 KGM 的增黏作用。在中性条件下，当添加1%的具有不同 取代度和不同分子质量的 CMKGM 样品时，仅有 CMKGM-1 能够有效稳定 PPD， 其他样品 (CMKGM -2~CMKGM-7)均不能起到稳定作用。由于在中性条件下，豌豆蛋白颗粒和多糖分子 均带负电荷，多糖的稳定作用主要来源于其增黏作用，然而对于 CMKGM-2~CMKGM-7 样品，由于分子质 量 逐渐降低，在相同质量分数下(1%)不能起到有效的增黏作用，故不能稳定 PPD。在pH3.5条件下， CMKGM-1、CMKGM-2 和 CMKGM-3 均能在一定程度上保持 PPD 的稳定，这是因为在酸性条件下豌豆蛋白带正电，带负电的 CMKGM 能够与豌豆蛋 白 发生静电吸附使 PPD-多糖复合物带负电，从而通过静电排斥作用和空间位阻作用阻碍蛋白颗粒的聚集。再加 上未吸附多余多糖分子的增黏作用，两者共同维持了 PPD 体系的稳定。然而，尽管CMKGM-4~CMKGM-7这4个样品的羧甲基的取代度增加有利于发挥其在酸性条件下稳定PPD体系中的静 电排斥作用，但是由于分子质量过低导致增黏作用大幅减弱，使这些样品在质量分数1%的 条件下不能稳定酸性 PPD体系。