单克隆抗体非变性SEC-MS分析用色谱柱的选择

单克隆抗体的表征对于产品的安全性和有效性至关重要。确定纯度和表征二聚体或片段等杂质是两个关键的质量参数。尺寸排阻色谱法与质谱联合使用在测定mAb精确分子量方面的应用也越来越广泛。然而，即使在高分子量m/z范围内执行操作，传统SEC一般都会产生大量的颗粒脱落，导致电离效率随时间推移逐渐降低。为避免MS和多角度光散射检测时产生颗粒脱落，东曹开发了TSKgel® UP-SW3000-LS U/HPLC尺寸排阻色谱柱。本应用中，我们使用了TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱与MS对mAb标准品进行了分析。数据表明，就MS观察到的颗粒脱落而言，TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱优于竞品UHPLC色谱柱和蛋白质SEC专用低脱落色谱柱。此外，与50次以上的初始进样相比，该色谱柱有助于将电喷雾电离（ESI）源的电离效率保持在90%以上。应用笔记TOSOH 单克 隆抗体 (mAb )的 表征 对 于产品 的 安 全性 和 有效 性至关重 要。确 定 纯度 和 表征二 聚 体或 片 段等 杂 质 是 两个 关键 的 质 量参 数 。尺 寸排 阻 色谱(SEC ) 法 与质 谱(MS)法联合使用 在 测 定 mAb 精 确 分 子量 方 面 的应用 也越来越 广泛 。然 而 ，即使在高分 子量 (HMW ) m/z 范围内 执 行操作，传 统 SEC 一般 都 会产生 大 量的颗粒 脱 落 ，导致 电 离 效率随 时 间推移 逐渐 降 低。为 避 免 MS 和多角 度光散 射 (MALS )检 测时 产 生颗粒 脱 落 ，东曹 开 发了 TSKgel @ UP-SW3000-LS U /HPLC 尺 寸排阻 色 谱柱 。 本文中 ，我 们使 用 了 TSKgel UP-SW3000-LS 色谱柱与 MS对 m A b 标 准 品进 行 了 分析 。数 据表 明，就 MS 观察到的颗粒 脱落 而言 ， TSKgel UPSW3000-LS 色 谱 柱优 于竞品 UHPLC 色 谱 柱 和 蛋白质 SEC 专用低脱 落色谱 柱。此外 ，与 50次以 上 的 初 始进 样 相 比，该色 谱 柱有助 于将 电 喷 雾 电离 (E SI ) 源 的 电离 效率 保 持 在 90%以 上。 实验条件 色谱柱： TSKgel UP-SW3000-LS，4.6 mm ID×15 cm (2 um)竞品 SEC U H PLC色谱 柱 ，4.6 mm IDx15 cm (1.7 um)光散 射专用 色谱 柱 ， 4.6 mm IDx15 cm (3 um) 仪器： UHPLC 仪 ： Shimadzu Nexera@ XR 质 谱 仪 ： SCIEX X500B QTOF 电 离 模 式 ： ESI ， 阳极模式 质 谱模 式 ： 扫描 ， TOF MS m/z 4000-8000 离子源气 体1： 50 psi 离子源气 体2： 50 psi 气帘气： 30 psi 方法和流动相： 流动相 ： 100 mmol /L 甲酸 铵 ， pH6.8 流 速 ： 0.2 mL/min 检测： UV @ 280 nm 温 度： 25℃ 进样量： 10uL CAD 气体： 7 psi 喷 雾 电 压： 5500V 源 温度 ： 4509℃ 去簇电压 ： 275V±20V 碰撞 能量： 5V 积累时间： 0.5 s 合计时 间 段 ： 80 完 整 蛋白 质模式脚本：开 Q1传 输 窗口 ： 2250 Da 下 100% 结果和讨论 使用 TSKgel UP-SW3000-LS 可降低 SEC -MS 下的颗粒脱落 根 据 我们的 首 次 观察结 果 ，颗 粒 脱 落 不会只在 特 定的保 留时 间 下发 生。该 现象 会在整 个洗脱过程种 连 续 发生。因此，我 们 决 定 收 集 3到15分 钟洗 脱 时 间内的累积数据 ，以此量 化 单次 SEC 运 行 期 间 色谱柱的 脱落量(见 图1)。 图11..使用 LC-MS 法 测 量 SEC 颗 粒脱 落的 实 验设计 我们计算了每根色谱柱中不同分子离子的测量强度，量 化了多 次运行 SEC 时色谱柱的颗粒脱落。分析序列包括10次平衡运 行(不进样)和10次普通运行(色谱柱中注入了流动相空白)。颗粒脱落的量化结果如图2所示，其中横轴为运行次数，纵轴 为颗粒脱落的强度或每秒计数 量 (cps)。 图 2.使用 LC -MS 量化 SEC 颗粒脱落 TSKgel UP-SW3000-LS 色谱柱 首 次 平 衡 后几 乎 无颗粒脱落，且 在颗 粒 脱 落 方 面 优 于竞品 UHPLC 色 谱 柱和光散 射 专 用 色谱 柱。由 于 首次平 衡 后无法 测 量颗粒 脱 落 ，因此 无 需在开始 分 析 前 长时 间 调 节 SEC 色谱 柱 。 使用 TSKgel UP-SW3000-LS 提高 SEC -MS的电离效率 我 们 通过测 定 了 28+峰 的 峰 面 积 ，来定量 NIST mAb 单 体洗 脱 峰 在 不同色 谱 柱上 连续 50次 以上 进样 的 MS电 离效率(见 图3和 图4)。我 们发 现 电 离 效 率降 低 与 高颗粒 脱落之 间 具有 相关性 。 TSKgel UP-SW3000-LS 色谱柱具 有 超低 的 高颗 粒脱 落 率，50次 以上 进样 时 ，可 保持 较高的 电 离效率(90%以 上 )。 图 3.SEC-MS 分析 mAb 图 4. 电喷雾电离 时 mAb 的电离效率 结论 使用 TSKge l UP-SW3000-LS 色 谱柱进 行 SEC-MS 分 析，有助 于 限 制色 谱 柱脱 落 ，能 够 显 著提高整 体分析性 能。相 较 于竞品色谱 柱，还 有 助 于通 过 降低 ESI 源 的 清 洗 频次 保证仪 器 的 正常运行 时 间 。因此 ，使用 T SKgel UP-SW3000-LS色 谱 柱时，不仅 SEC -MS 分 析 的 重 复性 和 可靠性更 高，通量 也 更 高。 产品列表 货号# 产品名称 色谱柱尺寸 23547 TSKgel UP-SW3000-LS 4.6 mm ID ×15 cm L 23546 TSKgel UP-SW3000-LS 4.6 mm ID×30cmL 23548 TSKgel guard column UP-SW-LS 4.6 mm ID × 20 cmL 23549 TSKgel guard column UP-SW-LS DC 4.6 mm ID×20 cmL