治疗性抗体中分子量表征检测方案(色谱检测器)

TOSOH 应用笔记 治疗性抗体的 SEC-MALS分析-—7稳健可靠的深度样品表征法 实验条件 为了展示 MALS 检测与尺寸排阻色谱法联用分析单克隆抗体的优势，我们采用了如下所述的 mAb 对照品和一种通用的分离方法。因为光散射对盐晶体、微生物或色谱柱脱落物等颗粒比 UV检测更加敏感，为了获得最优质量的 MALS 数据，采取了以下匹配措施：流动相两次过滤；使用光散射专用 UHPLC 色谱柱(TSKgelUP-SW3000-LS)，该柱曾与其他两种色谱柱进行比较，其噪音水平最低；选择LenS3 MALS 检测器，其具有较高的灵敏度可以表征低丰度的杂质。 SEC-MALS 分析 mAbs 时的灵敏度和稳健性 接下来，通过进样一式三份的1：5 稀释的系列 mAb 样品来测定SEC-MALS 分析mAb 时的稳定性和灵敏度。表1所示为注入不同浓度的单体、二聚体和片段时的MW 测定结果。由于这些分子在样品中的比重不同，给定总蛋白质浓度下每种分子的进样量也进行了计算和说明。 对于单体，我们发现低至 14 ng 的MW 测定值也在统计平均值±5%范围内。然而，随着进样量的减少，精确度随之降低，标准偏差随之增大。针对于二聚体MW的测定，情况比较类似。最低进样量到 12 ng时，计算出的MW 为 317kDa (+6%) 和变异系数高达6.3%。相反，在较高浓度下，二聚体MW的测定比较准确(与统计平均值偏差<2%)，变异系数也很低(%CV<1.1%)。同样，针对于小Fab 片段(48kDa)， 显示可靠的 MW测定最低样品量低至 33 ng。而低到7ng的最低进样量时，则会导致MW 测定不准、三次测量间的变异系数高。其原因不仅是分析物含量低，而且是由于分子越小，散射光量也会越低。 结论 使用 SEC-MALS 分析单克隆抗体样品时，可以直接测定样品组分的MW， 便于峰的杂质结构归属。高灵敏度的 LenS3 MALS 检测器对抗体二聚体的灵敏度低至 50ng 以下，测定单体和杂质的MW 的浓度可低至 15 ng。但此时准确度稍低、偏差较大。 总蛋白浓度 重量占比 注入的蛋白质 RALS 的平均 MW 标准差 % CV (pg/ml) (ng) (Da) (Da) 单体(149kDa) 1000 8590 150，360 64 0.04 200 1718 149，711 39 0.03 40 85.9% 344 149，681 280 0.2 8 69 153，420 1，124 0.7 1.6 14 142，839 4，562 3.2 二聚体(298kDa) 1000 288 295，265 3，067 1.0 200 2.9% 58 302，324 2，399 0.8 40 12 316，672 20，025 6.3 片段(48kDa) 1000 166 47，158 243 0.5 200 1.7% 33 48，348 175 4.5 140 7 60，079 11，311 18.8 多角度光散射（MALS）法适用于测定样品组分的分子量，可以更好地了解分子的聚集体和片段。本应用中采用了光散射专用的UHPLC色谱柱TSKgel UP-SW3000-LS搭配东曹公司的LenS3多角度光散射检测器针对单克隆抗体进行了分析。分析结果表明，高灵敏度的LenS3光散射检测器对抗体二聚体的灵敏度低至50 ng以下，测定单体和杂质的MW的浓度可低至15 ng。