保健品中42种非法添加物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-649 岛津应用云岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 检测保健品中42种非法添加物 LCMSMS-649 摘要：本文建立了一种快速检测保健品中42种非法添加化学物质高效液相色谱-串联质谱法。样品经甲醇萃取后，使用五氟苯基丙基色谱柱(100 mm×2.1 mm， 5um)分离，以乙腈、20 mmol/L 乙酸铵和 0.1%甲酸缓冲水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测模式测定，外标法定量。结果表明：42种化学物质在10~1000 ng/mL 浓度范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.99；检出限和定量限分别为 0.5~10 ng/g和1~50 ng/g； 42 种化学物质在空白基质中3个添加水平下的平均回收率为80.6%~136.8%，相对标准偏差为0.41%~13.44%。该方法操作简单，检测覆盖范围广、耗时少、准确度高，适用于保健品中非法添加化学物质的快速筛查和定量分析。 关键词：高效液相色谱-串联质谱法 保健品 多反应监测 非法添加物 我国保健品行业发展起始于20世纪80年代，改革开放之后，国民经济水平不断提高，人们对保健品的需求不断上升。保健品行业经历了20世纪90年代至21世纪初的飞速发展阶段，到近年来的整体市场趋向于更加精细化、更加高品质的发展阶段，同时， 监管新政不断出台，推动行业规范化发展。 目前保健品中非法添加化学物质的问题仍然比较突出，这些非法化学添加物质主要有6大类：减肥类、降糖降脂类、降压类、止咳类、精神类和壮阳类。现有非法添加化学物质的检测方法主要有：拉曼光谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、近红外光谱法以及液相色谱-质谱联用法等，高效液相色谱-四级杆飞行时 间串联质谱法和高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱质谱法，但可筛选的化学添加物质数量有限。近些年来国家食品药品监督管理总局不断出台关于保健品非法添加的补充检验方法，但是随着不法分子对添加物质和添加手段不断改进，现行方法覆盖范围难以满足市场上保健品非法添加的检测要求。 本文在现行国家标准基础上选择了6大类42种保健品中常见的非法添加的化学物质作为目标物，采用高效液相色谱-串联质谱法建立了一个高通量筛查、定量分析保健品中42种非法添加化学物质的方法，用于实际样品检测。 1.1仪器 岛津三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统。具体配置为 输液泵： LC-30AD×2 在线脱气机： DGU-20A5 自动进样器：SIL-30AC 柱温箱： CTO-20AC 系统控制器： CBM-20A 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.97 质谱仪： LCMS-8045 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Restek-Ultra II PFPP (100mm×2.1mm， 5um) 流动相：A相-20mM 乙酸铵水溶液含有0.1%(体积分数)甲酸； B相-乙腈 流速：0.3mL/min 柱温：40℃ 进样体积：1uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始流动相比例为10%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 3.00 泵 B.Conc 20 8.00 泵 B.Conc 75 10.00 泵 B.Conc 95 10.10 泵 B.Conc 10 12.00 控制器 Stop LCMS-8045 质谱条件： 离子源： ESI(+)接口电压：4kV雾化气流速：3L/min加热模块温度：400℃加热气流速：10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)接口温度：300℃干燥气流速：10.0L/min DL温度：250C MRM参数：见表2 表2 MRM优化参数 No. 名称 CAS 保留时间肓前体离子产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 盐酸西布曲明 106650-56-0 10.393 280.15 124.95* 138.90 -30 -14 -24 -15 -22 -26 2 盐酸N-单去甲西布曲明 84467-94-7 8.589 266.2 124.95* 138.95 -20 -22 -25 -14 -20 -22 124.90* -13 -20 -22 3 盐酸N，N-双去甲西布曲明 84484-78-6 7.389 252.2 152.90 -13 -9 -18 4 盐酸氯卡色林 616202-92-7 5.003 196.05 129.05* 144.10 -21 -20 -29 -21 -23 -27 5 奥利司他 96829-58-2 2.530 496.4 319.20* 160.00 -14 -14 -13 -12 -23 -30 6 酚酞 77-09-8 1.098 319.1 224.95* 141.00 -16 -16 -20 -40 -24 -26 7 麻黄碱 299-42-3 3.734 166.1 148.10* -13 -13 -29 133.05 -13 -21 -24 8 盐酸丁二胍 1190-53-0 3.605 158.15 60.05* -12 -15 -23 57.05 -13 -24 -22 9 盐酸二甲双胍 657-24-9 3.327 130.15 71.05* -14 -21 -29 60.00 -14 -14 -24 10 114-86-3 3.859 206.15 60.10* -10 -17 -23 盐酸苯乙双胍 105.05 -10 -26 -20 11 辛伐他汀 79902-63-9 1.446 419.3 199.05* -21 -13 -20 285.05 -21 -11 -20 31 烟酸 59-67-6 1.715 124.1 78.00 -14 -22 -29 79.95* -14 -22 -30 32 西地那非 139755-83-2 2.123 475.2 58.00 -24 -44 -24 100.00* -23 -29 -19 33 豪莫西地那非 642928-07-2 2.543 489.2 113.05* -14 -30 -21 98.95 -14 -36 -17 34 枸橼酸羟基豪莫西地那非 139755-85-4 1.583 505.15 99.05 -24 -41 -19 129.00* -24 -31 -24 35 那莫西地那非 371959-09-0 1.387 460.2 283.00 -22 -35 -30 311.10* -23 -37 -22 36 红地那非 831217-01-7 4.259 467.2 127.10 -13 -32 -24 297.05* -13 -41 -30 37 那红地那非 949091-38-7 4.184 453.25 297.10* -13 -41 -30 166.10 -13 -52 -30 38 伪伐地那非 224788-34-5 1.349 460.25 312.10* -23 -42 -21 284.05 -23 -37 -30 39 盐酸伐地那非 224785-90-4 2.157 489.25 151.00 -24 -46 -28 312.05* -14 -40 -21 40 硫代艾地那非 856190-47-1 1.580 505.2 112.95 -24 -31 -21 299.00* -24 -40 -30 41 他达那非 171596-29-5 1.124 390.2 134.95 -19 -20 -26 268.00* -19 -14 -18 42 氨基他达那非 385769-84-6 1.087 391.15 262.00 -20 -32 -27 269.10* -20 -15 -29 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配置 分别准确称取42种非法添加化学物质标准品10mg (精确至0.1mg)，置于10mL容量瓶，用甲醇定容，配置成1 mg/mL的标准储备液；用甲醇稀释至1 ug/mL于-20℃避光保存；再用甲醇配制成不同浓度的标准工作液，供上机使用。 1.4样品前处理方法 准确称取样品约10 mg， 置于 15mL聚乙烯离心管中，加入10 mL甲醇，超声萃取30 min， 冷却至室温，3500 r/min 离心3 min，取上清液1 mL通过0.22 um滤膜，滤液在50℃下使用高纯氮气吹干，用200uL甲醇复溶，转移至样品瓶，供液质检测。 基质匹配样品制备：取空白样品，按上述方法制备空白基质溶液，上机前使用空白基质溶液稀释42种化学物质混合标准溶液，制成基质混合标准溶液。 结果与讨论 2.1色谱图 本研究对比了C18柱，发现在C18柱上保留较弱，而PFPP柱分子中含有5个氟原子，具有较强的氢键作用力和阳离子交换作用力，因此选用 Restek-Ultra lI PFPP 液相色谱柱。采用1.2所述的梯度洗脱方法，得到的 42种化学物质的总离子流色谱图如图1所示。 图1 42种化学物质的总离子流图 2.2线性范围 按1.4所述方法配制系列基质混合标准溶液，以各化学物质的色谱峰峰面积(y)对进样质量浓度 (x， ng/mL)进行回归计算，42种化学物质的线性回归方程及相关系数(r)如表3所示。结果表明，42种化学物质在10~1000 ng/mL 质量浓度范围内与色谱峰峰面积呈良好的线性关系，相关系数 rr²均在0.9903~0.9997。在空白样品中添加系列质量浓度的混合标准溶液，得到检出限 (limits of detection， LOD)和定量限((limits ofquantification， LOQ)。结果表明，42种化学物质的 LOD 为 0.5~10 ng/g， LOQ 为1~50 ng/g， 能够满足非法化学添加物质的检测要求。 表3 校准曲线、检出限和定量限 序号 化合物 线性范围 校准曲线 相关系数 检出限 定量限 (ng/mL) (ng/g) (ng/g) 盐酸西布曲明 10~1000 v=78 054.6x-171586 0.9983 0.5 1 2 盐酸N-单去甲西布曲明 10~1000 y=69 306.1x+104 384 0.9988 1.0 10 3 盐酸N，N-双去甲西布曲明 10~1000 y=18554.6x+195 736 0.9952 5.0 10 4 盐酸氯卡色林 10~1000 v=11815.1x+11828.1 0.9982 10 15 奥利司他 10~1000 v=15586.4x+26 171.7 0.9994 6 酚酞 10~1000 y=17 488.0x-80 553.2 0.9997 0.5 7 麻黄碱 10~1000 v=91 950.3x+21 20340 0.9907 1.0 10 8 盐酸丁二胍 10~1000 y=123 947x+4 742 940 0.9924 0.5 9 盐酸二甲双胍 10~1000 v=42 987.8x+1259 590 0.9922 0.5 10 盐酸苯乙双胍 10~1000 v=113 464x+4 884 600 0.9911 0.5 1 11 辛伐他汀 10~1000 y=1477.54x+4577.10 0.9982 5.0 10 12 瑞格列奈 10~1000 v=215 630x+6 878 780 0.9996 0.5 1 13 盐酸罗格列酮 10~1000 v=134 866x+4139 280 0.9929 0.5 1 14 格列齐特 10~1000 v=27296.7x-392 677 0.9995 0.5 1 15 格列喹酮 10~1000 v=15 039.9x-192 157 0.9995 5.0 10 16 甲苯磺丁脲 10~1000 y=3 304.91x-37776.8 0.9989 10.0 50 17 卡托普利 10~1000 y=6945.56x-669 41.7 0.9996 10.0 50 18 苯磺酸氨氯地平 10~1000 y=10 526.3x+259 934 0.9989 5.0 10 19 尼群地平 10~1000 y=1597.96x+16 429.5 0.9981 5.0 10 20 非洛地平 10~1000 y=9 228.80x+72993.8 0.9966 5.0 10 21 盐酸哌唑嗪 10~1000 v=66 061.2x+2 576 920 0.9903 0.5 1 22 盐酸可乐定 10~1000 y=2944.74x+45 751.0 0.9932 1.0 10 23 可待因 10~1000 y=3477.02x+89 840.4 0.9934 1.0 10 24 福尔可定 10~1000 v=53 039.8x-40537.6 0.9957 1.0 10 25 盐酸氯丙那林 10~1000 y=71 140.3x+1 008 360 0.9956 1.0 10 26 盐酸二氧丙嗪 10~1000 v=153 185x+844 475 0.9977 1.0 10 27 盐酸氟西汀 10~1000 y=37021.1x-208 802 0.9996 1.0 5 28 扎来普隆 10~1000 v=9 259.29x-36263.8 0.9992 1.0 10 29 丁丙诺非 10~1000 v=14 929.4x+132 475 0.9972 5.0 10 30 硝苯地平 10~1000 y=53814.8x-365 761 0.9987 0.5 31 烟酸 50~1000 v=1126.79x+3641.12 0.9957 50.0 100 32 西地那非 10~1000 y=16532.7x+539 519 0.9911 1.0 10 33 豪莫西地那非 10~1000 y=26074.7x+730 380 0.9926 1.0 10 34 枸橼酸羟基豪莫西地那非 10~1000 y=16102.4x+367 181 0.9938 1.0 10 35 那莫西地那非 10~1000 y=6 425.55x-39 678.9 0.9995 1.0 10 36 红地那非 10~1000 y=25 242.9x+311344 0.9960 1.0 10 37 那红地那非 10~1000 y=20 524.2x+335 229 0.9954 1.0 10 38 伪伐地那非 10~1000 y=57 512.4x+971623 0.9941 1.0 10 39 盐酸伐地那非 10~1000 y=38 123.6x+525 248 0.9961 1.0 10 40 硫代艾地那非 10~1000 y=15 336.8x+465 020 0.9904 1.0 10 41 他达拉非 10~1000 y=2135.78x+2895.78 0.9977 1.0 10 42 氨基他达拉非 10~1000 v=678.36x+3 320.78 0.9972 1.0 10 2.3重复性 选取 1 ug/g混合标准溶液，在同一实验条件下连续10次平行实验以评价方法稳定性，分别计算保留时间和出峰面积的相对标准偏差。结果表明，42种化学物质保留时间 RSD 为0.059%~0.287%，峰面积RSD 为0.536%~2.640%，方法稳定性理想。 2.4加标回收 以空白样品为基质，分别选取低质量浓度(30ng/g) 中质量浓度 (600ng/g) 和高质量浓度(1000 ng/g)3个水平的混合标准溶液，按优化后的实验条件，每个水平做6次平行实验，连连3d。结果显示，在空白基质中所有化学物质的回收率相对标准偏差 (relative standard deviation， RSD) 均小于15%，满足精密度要求。42种化学物质的平均回收率为80.6%~136.8%，RSD 为 0.41%~13.44%，方法的随机误差满足测定要求。 表4 基质加标实验结果(n=6) 序号 化合物 30 ng/g 600 ng/g 1000ng/g 序号 化合物 30ng/g 600ng/g 1000 ng/g (%) (%) (%) (%) (%) (%) 盐酸西布曲明 104.1 109.9 108.2 22 盐酸可乐定 83.1 96.8 97.5 2 盐酸N-单去甲 西布曲明 136.3 106.3 96.4 23 可待因 98.7 112.9 111.6 3 盐酸N，N-双去 甲西布曲明 123.8 110.1 111.1 24 福尔可定 88.5 99.6 96.1 4 盐酸氯卡色林 102.1 101.8 100.6 25 盐酸氯丙那林 99.2 113.2 111.9 5 奥利司他 113.4 108.5 100.1 26 盐酸二氧丙嗪 99.3 103.7 99.3 6 酚酞 101.3 109.9 108.2 27 盐酸氟西汀 93.8 98.6 90.6 7 麻黄碱 81.9 98.4 99.2 28 扎来普隆 103.9 105.1 99.9 8 盐酸丁二胍 90.2 91.1 81.2 29 丁丙诺非 103.5 99.6 87.6 9 盐酸二甲双胍 96.6 105.9 103.0 30 硝苯地平 111.2 105.9 98.9 10 盐酸苯乙双胍 103.6 109.1 110.4 31 烟酸 120.3 107.5 97.6 11 辛伐他汀 80.6 103.2 98.9 32 西地那非 105.6 102.2 99.6 12 瑞格列奈 86.8 101.9 94.2 33 豪莫西地那非 109.5 100.9 99.0 13 盐酸罗格列酮 98.4 98.0 100.7 34 枸橼酸羟基豪 莫西地那非 102.5 101.2 104.2 14 格列齐特 117.4 108.1 100.1 35 那莫西地那非 112.8 106.3 98.6 15 格列喹酮 136.8 106.3 93.5 36 红地那非 122.5 107.5 99.9 16 甲苯磺丁脲 91.7 108.5 102.0 37 那红地那非 109.1 102.8 103.5 17 卡托普利 132.6 106.6 99.4 38 伪伐地那非 114.2 103.3 97.9 18 苯磺酸氨氯地平 105.4 103.6 93.5 39 盐酸伐地那非 106.5 99.8 97.6 19 尼群地平 119.9 107.9 113.7 40 硫代艾地那非 100.5 102.7 104.4 20 非洛地平 133.5 103.6 93.9 41 他达拉非 89.9 101.4 100.5 21 盐酸哌唑嗪 125.2 98.8 93.4 42 氨基他达拉非 90.2 104.5 110.6 2.5实际样品检测 按照上述方法，分别检测了深圳某派出所和某海关送检的多份样品。分析结果表明：送检的保健品中，3份样品检出他达拉非，定量结果分别为5.5、9.4和7.9 mg/g；2份分别检出西布曲明和酚酞，定量结果分别为74.7和586.0 mg/g；1份检出为氟西汀，定量结果为18.6mg/g； 以上结果均被办案机关依法采信。 结论 本研究建立了 LC-MS/MS快速筛选和测定保健品中42种非法添加化学物质的分析方法。该方法样品前处理简便，分析覆盖范围广、耗时少、准确度高，能满足对保健品中非法添加物质的测定要求。在实际样品的检测中，按照本方法对相关办案机关送检的保健品检测，非法添加的化学物质均被准确筛查和定量检测并出具司法鉴定意见书，所有送检样品的检测结果均被办案机关依法采信。 本研究建立了LC-MS/MS 快速筛选和测定保健品中42种非法添加化学物质的分析方法。该方法样品前处理简便，分析覆盖范围广、耗时少、准确度高，能满足对保健品中非法添加物质的测定要求。在实际样品的检测中，按照本方法对相关办案机关送检的保健品检测，非法添加的化学物质均被准确筛查和定量检测并出具司法鉴定意见书，所有送检样品的检测结果均被办案机关依法采信。