银杏叶提取物中萜类内酯含量检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA22-092Excellence in Science Excellence in ScienceLC-285 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn ATLAS-LEXT NHD 自动前处理装置用于银杏叶提取物中萜类内酯的含量分析 LC-285 摘要：本文使用 ATLAS-LEXT NHD 自动前处理装置，参考《中国药典》分析方法，自动液液萃取银杏叶提取物中萜类内酯，使用超高效液相色谱-蒸发光散射检测法去(UHPLC-ELSD) 进行定量分析。结果显示：萜类内酯检出限在0.007 ug ~0.030 ug之间，定量限在0.024 ug~0.099 ug之间，加标回收率为97.8%~103.6%。与手动液液萃取相比，在本例中，自动液液萃取较手动液液萃取试剂和样品消耗量降低95%、耗时缩短40%、通量提升6倍。 关键词： ATLAS-LEXTNHD银杏叶提取物萜类内酯EELSD 萜类内酯是银杏叶提取物中一类重要的活性成分，具有独特的十二碳骨架结构，对血小板活化因子 (PAF)受体有强大的特异性抑制作用，被认为是最有临床应用前景的天然 PAF 受体拮抗剂。 《中国药典》中提供了银杏叶提取物中萜类内酯含量的测定方法，并对萜类内酯总量提出要求。药典采用液液萃取方法，使用高效液相色谱--蒸发光散射 检测器进行定量分析。 本文参考《中国药典》分析方法，采用ATLAS-LEXT NHD 自动前处理装置对杏杏叶提取物进行自动化液液萃取，试剂和样品消耗量小、耗时短、通量大、人力成本低，且具有优异的回收率和重复性，可供相关人员参考。 1.1仪器 ATLAS-LEXT NHD 自动前处理装置及岛津LC-40-ELSD 液相色谱系统。 图11AATLAS-LEXT NHD(左)和LC-40-ELSD (右) 1.2试验条件 1.2.1 ATLAS-LEXT NHD 前处理条件 混合强度：9级混合时间：180 sec离心速度：5000 rpm离心时间：60 sec样品瓶架类型：3清洗溶液：30%甲醇-水 1.2.2 LC分析条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (100 mm×2.1 mm I.D.， 3um； P/N： 227-30008-05， SGLC) 流速：0.4 mL/min 进样量：0.5-1uL 柱温：35℃ 洗脱方式：等度洗脱 流动相：正丙醇：四氢呋喃：水(1：15：84) 检测器：ELSD，漂移管40℃，增益Wide，过滤器4s 1.3对照提取物溶液的制备 取银杏叶总内酯对照提取物适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含2.5mg的溶液，即得。注：本文使用的银杏叶总内酯对照提取物各成分百分含量为：白果内酯：35.81%，银杏内酯A： 27.41%，银杏内酯B：16.67%，银杏内酯C：13.00%。 1.4供试品溶液的制备方式 1.4.1手动液液萃取流程 照《中国药典》处理，取银杏叶提取物150 mg， 精密称定，加水10mL，置浴浴中温热使溶散，加2%盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(15mL、10 mL、10mL、10mL)，合并提取液，用5%醋酸钠溶液20mL洗涤， 取醋酸钠溶液层，再用乙酸乙酯10 mL洗涤，合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次20 mL， 取水层，用乙酸乙酯10 mL洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，0.22 um 滤膜过滤，即得。 1.4.2 ATLAS-LEXT NHD 自定义程序自动液液萃取过程 图2 ATLAS-LEXT NHD 自动液液萃取过程和软件命令控制 取银杏叶提取物7.5 mg， 精密称定，加水0.5 mL， 置水浴中温热使溶散，加2%盐酸溶液3uL，置于ATLAS-LEXT NHD 样品盘中，利用 ATLAS 自定义程序完成样品液液萃取过程。流程如下：用乙酸乙酯振摇提取4次(0.75mL、0.5mL、0.5 mL、0.5mL)，进样针吸液高度6.9mm，合并提取液，用5%醋酸钠溶液1mL洗涤提取液，进样针吸液高度0.1mm，分取醋酸钠溶液，再用乙酸乙酯 0.5 mL洗涤，进样针吸液高度10.9mm，合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次1mL，进样针吸液高度0.1 mm， 分取水液，用乙酸乙酯0.5mL洗涤，进样针吸液浓度18.4 mm， 合并乙酸乙酯液。氮吹至干，用250uL甲醇复溶，混匀，0.22um滤膜过滤，即得。 1.5测定法 分别精密吸取对照提取物溶液5 pL、10uL， 供试品溶液5uL， 注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量。 结果与讨论 2.1手动与自动前处理对比 分别采用手动液液萃取和 ATLAS-LEXT NHD自动化液液萃取，比较了萃取过程中的试剂用量、时间消耗等，部分对比结果见表1和图3。结果显示，自动液液萃取较手动液液萃取试剂和样品消耗量降低95%、耗时缩短40%、通量提升6倍。 表1 手动与自动前处理试剂用量、耗时及通量对比 液液萃取 试剂用量(mL/样品) 时间 (min/样品) 通量 过程 手动萃取 自动萃取 手动萃取 自动萃取 手动萃取 自动萃取 乙酸乙酯提取 45 2.25 20 12 1 6 醋酸钠溶液洗涤 20 1 5 3 1 6 乙酸乙酯洗涤 10 0.5 5 3 1 6 水洗涤 40 2 10 6 1 6 乙酸乙酯洗涤 10 0.5 5 3 1 6 合计 125 6.25 45 27 一 图3手动与自动前处理试剂用量、耗时及通量对比图 2.2特征图谱 按照1.2.2分析条件，对空白溶剂、对照提取物溶液分别上机分析，空白溶剂和对照提取物溶液色谱图对比如图3所示，目标物出峰处无干扰。 图3空白溶剂和对照提取物溶液色谱图 2.3系统适用性考察 理论塔板数按白果内酯峰计算为9573，《中国药典》系统适用性项下规定应不低于2500，本实验结果满足《中国药典》规定。 2.4检出限、定量限及精密度 Labsolutions 软件依据信噪比自动计算检出限(S/N=3)及定量限(S/N=10)，结果见表2。进样量0.5uL，将对照提取物溶液连续测定6次，考察HPLC系统精密度。萜类内酯的保留时间 RSD 值在0.04%~0.10%之间，峰面积 RSD 值在 2.04%~2.80%之间，仪器精密度良好，详见表2。 表2 HPLC 方法学考察结果 化合物 检出限(ug) 定量限(ug) 保留时间 RSD(%) 峰面积RSD(%) 白果内酯 0.007 0.024 0.04 2.59 银杏内酯A 0.011 0.037 0.05 2.57 银杏内酯B 0.030 0.099 0.10 2.04 银杏内酯C 0.013 0.043 0.06 2.80 2.5加标回收率 精密称取已知萜类内酯含量的银杏叶提取物样品2组，每组6份，再分别加入银杏叶总内酯对照提取物。第一组按照“1.4.1手动液液萃取流程”，第二组按照“1.4.2 ATLAS-LEXT NHD 自定义程序自动液液萃取过程”制备供试品溶液，上机分析并计算回收率。添加量及加标回收率结果如下图表所示。结果显示， ATLAS-LEXT NHD自动化液液萃取的回收率和重复性与手动液液萃取相当。 表3 加标回收率结果(n=6) 前处理方式 化合物 样品测定值 (ug) 添加量 (ug) 实测值 (ug) 平均回收率 (%) RSD (%) 白果内酯 0.5408 0.0895 0.6238 92.7 3.32 手动萃取 银杏内酯A 0.3611 0.0685 0.4271 96.4 5.90 银杏内酯B 0.2077 0.0417 0.2461 92.1 1.52 银杏内酯C 0.2139 0.0325 0.2468 101.2 3.23 自动萃取 白果内酯 0.4755 0.0895 0.5645 99.4 2.76 银杏内酯A 0.3092 0.0685 0.3802 103.6 1.81 银杏内酯B 0.1976 0.0417 0.2404 102.6 2.28 银杏内酯C 0.1901 0.0325 0.2219 97.8 2.40 图4手动萃取和自动萃取对待测物回收率的影响 2.6实际样本分析的应用 按照“1.4.2ATLAS-LEXT NHD 自定义程序自动液液萃取过程”平行制备6个样本供试品溶液，上机分析，测定结果见表4。 表 4 样品测定结果 化合物 测定值(ug) 平均值 RSD 样品量 萜类内酯 1 2 3 4 5 6 (g) (%) (mg) 占比(%) 白果内酯 247.5 235.6 231.8 244.0 235.2 232.4 237.8 2.73 银杏内酯A 157.0 151.0 149.0 159.6 158.7 152.4 154.6 2.84 7.49 7.83 银杏内酯B 96.10 100.05 97.60 101.4 100.8 96.90 98.8 2.24 银杏内酯C 99.65 93.20 93.20 96.05 95.55 92.75 95.05 2.76 结论 本文建立了 ATLAS-LEXT NHD 自动化液液萃取银杏叶提取物中萜类内酯，使用超高效液相色谱-蒸发光散射检测法 (UHPLC-ELSD) 进行定量分析的方法。ATLAS-LEXT NHD 可进行自定义液液萃取过程，试剂和样羊消耗量小、耗时短、通量大、人力成本低，且具有优异的回收率和重复性，为中药材自动化前处理提供新的方案，可供相关人员参考。 岛津应用云 本文建立了ATLAS-LEXT NHD自动化液液萃取银杏叶提取物中萜类内酯，使用超高效液相色谱-蒸发光散射检测法（UHPLC-ELSD）进行定量分析的方法。ATLAS-LEXT NHD可进行自定义液液萃取过程，试剂和样品消耗量小、耗时短、通量大、人力成本低，且具有优异的回收率和重复性，为中药材自动化前处理提供新的方案，可供相关人员参考。