脑脊液中A1-42和A1-40检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-571Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-561 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 CL 同时测定人脑脊液中淀粉样蛋白A31-42和A31-40 LCMSMS-561 摘要：本文利用岛津临床用 LCMS-8050 CL 三重四极杆液质联用系统建立了人脑脊液中淀粉样蛋白AB1-42和AB1-40同时分析的方法，该方法采用内标法定量，对方法的线性、准确度及精密度进行考察，结果显示：该方法线性良好，线性相关系数均在0.998以上；0.2 ng/mL混合标准溶液，连续进样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别小于0.14%和8.89%，仪器精密度良好；质控测定结果与理论值接近，回收率在93.1~105.0%之间，平行处理三次的相对标准偏差在1.0~4.8%之间，可用于实际样品的检测。 关键词：LCMS-8050 CL 三重四极杆液质联用系统 脑脊液 淀粉样蛋白 阿尔茨海默病 (AD) 是一种与衰老相关的进行性发展的神经系统退行性疾病。由于平均寿命的延长，AD的患病率急剧上升，由于其高昂的财务成本和沉重的社会负担， AD 正成为主要的公共卫生问题之一。有研究表明， AD 的病理过程可能在临床症状出现之前几十年就开始了。因此， AD的早期诊断对于减缓 AD 的退化过程和启动预防性治疗具有重要意义。 β-淀粉样蛋白(amyloid-3， A3)是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein， APP)经β-和y-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39~43个氨基酸的多肽，被广泛用于 AD的早期诊断。它可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在。人体内Aβ最常见的亚型是A31-40和AB1-42， AB1-42具有更强的 毒性，且更容易聚集，从而形成AB沉淀的核心，引发神经毒性作用。AB的沉积不仅与神经元的退行性病变有关，而且可以激活一系列病理事件，包括星型胶质细胞和小胶质细胞的激活、血脑屏障的破环和微循环的变化等，是AD 病人脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因。目前，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫亲和富集-LC/MRM-MS 和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)是最常用的AB定量测定方法。但在Aβ肽的定量过程中，由于其易于自聚集、非特异性吸附及低内源性浓度等问题导致AB肽的定量具有一定的挑战。 本文采用岛津临床用三重四极杆液质联用系统LCMS-8050 CL，建立了人脑脊液中淀粉样蛋白AB1-42和AB1-40同时分析的方法，该方法灵敏度高、分析速度快，供相关人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用系统。具体配置为： 系统控制器：CBM-20A CL 脱气机：DGU-20As CL 输液泵： LC-30AD CL ×2自动进样器：SIL-30ACMP CL柱温箱： CTO-30A CL色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.98 1.2溶液配制 标准储备液的配制：使用1%氨水将AB1-42和AB1-40标准品及内标溶解配制成一定浓度的标准品储备液。 标准曲线的配制：取 AB1-42和AB1-40标准品储备液，用乙腈-水-氨水的混合溶液将储备液稀释到1ug/ mL的混合标准溶液，再用人工脑脊液将混合标准溶液稀释为标准系列工作溶液，浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20 ng/mL。 内标工作液配制：取 A31-42和AB1-40内标准品储备液，用乙腈-水-氨水的混合溶液将内标储备液稀释为100 ng/mL内标准品工作溶液。 结果与讨论 2.1标准曲线最低点 MRM 色谱图 4.59e3 图1 标准曲线最低点 MRM 色谱图 2.2线性范围 按照1.2配制标准系列工作溶液，处理后上机分析，以内标法绘制标准曲线，标准曲线如图2，曲线结果如下表3所示，所得校准曲线线性关系良好，线性相关系数在0.998以上，准确度在94.4%-108.6%之间。 图2 AB1-42和AB1-40标准曲线 表3 标准曲线结果 化合物 线性方程 线性范围 (ng/mL) 相关系数 准确度(%) A31-42 Y=(0.124474)X+(0.0132908) 0.2-20.0 0.998 94.4-108.6 A31-40 Y=(0.0970314)X+(0.00323620) 0.1-20.0 0.999 96.3-103.9 2.3仪器精密度 0.2 ng/mL 混合标准溶液，连续进样6次，考察保留时间和峰面积的重复性，结果如下表4所示。保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别小于0.14%和8.89%，仪器精密度良好。 表4 重复性测试 (n=6) 化合物 0.2ng/mL 保留时间 RSD% 峰面积 RSD% A31-42 0.14 8.81 A31-40 0.11 8.89 2.4方法准确度及精密度 人工脑脊液中添加低、中、高三个不同浓度的标准溶液作为质控，每个浓度的质控平行处理三份，结果如表5所示，结果显示：质控测定结果与理论值接近，回收率在 93.1~105.0%之间，：平行处理三次的相对标准偏差在1.0~4.8%之间，满足临床测定需求。 表5 质控准确度及精密度(n=3，浓度单位 ng/mL) 质控 项目 A31-42 AB1-40 LQC 理论浓度 0.50 0.50 测定浓度 0.51 0.48 回收率% 102.0 96.0 RSD% 3.5 4.8 MQC 理论浓度 4.0 4.0 测定浓度 4.2 3.8 回收率% 105.0 95.0 RSD% 2.9 2.5 HQC 理论浓度 16.0 16.0 测定浓度 14.9 15.6 回收率% 93.1 97.5 RSD% 1.0 1.1 2.5临床样本测定结果 取两份实际脑脊液样本，处理后上机分析，结果见图3和表6。 图3样品1测试色谱图 表6 临床样本测定结果 (ng/mL) 化合物 样品1 样品2 AB1-42 0.22 N.D. A31-40 1.06 1.32 结论 本实验建立了一种使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 联用测定人脑脊液中淀淀粉蛋白A31-42和A31-40同时分析的方法。采用内标法定量，质控测定结果与理论值接近，回收率在93.1~105.0%之间，平行处理三次的相对标准偏差在1.0~4.8%之间，该方法灵敏度高、分析速度快、专属性强，司可用于人脑脊液中淀粉样蛋白AB1-42 和AB1-40含量测定，供相关从业人员参考。 岛津应用云 本文利用岛津临床用LCMS-8050 CL三重四极杆液质联用系统建立了人脑脊液中淀粉样蛋白Aβ1-42和Aβ1-40同时分析的方法，该方法采用内标法定量，对方法的线性、准确度及精密度进行考察，结果显示：该方法线性良好，线性相关系数均在0.998以上；0.2 ng/mL混合标准溶液，连续进样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别小于0.14%和8.89%，仪器精密度良好；质控测定结果与理论值接近，回收率在93.1~105.0%之间，平行处理三次的相对标准偏差在1.0~4.8%之间，可用于实际样品的检测。