猪肉中廋肉精类检测方案

分子印迹固相萃取柱净化-GC-MS/MS 测定猪肉中的瘦肉精类化合物 (北京普析通用仪器有限责任公司) 1.方法概述 本方法使用分子印迹固相萃取柱代替 GB/T22286-2008中使用的阳离子交换柱对瘦肉精进行提取净化，与国标方法比较，猪肉中沙丁胺醇、特布他林、莱克多巴胺、克仑特罗的回收率均优于国标方法。 2.适用范围 猪肉中沙丁胺醇、特布他林、莱克多巴胺、克仑特罗的测定。 3.仪器与试剂 3.1仪器与设备 高效液相色谱-串联质谱联用仪，配有电喷雾离子源(ESI)； 电子天平，固相萃取装置，涡旋混合器，微量移液器，离心机，氮吹仪，水平振荡器，pH计，超声波清洗器。 3.2试剂 瘦肉精类分子印迹固相萃取柱(40mg/mL，北京普析通用仪器有限责任公司)，乙酸钠(CH3COONa3H20)(分析纯)，高氯酸：70%~72%(优级纯)，氢氧化钠(优级纯)，二甲酚橙(>95%)，氯化钠，，氨水，甲酸(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，乙酸(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，异丙醇-乙酸乙酯(6十4，体积比)， 0.1%甲酸水溶液-甲醇溶液(95+5，体积比)，甲醇乙酸(9：1)，2%甲酸水溶液。 3.3标准品 当购买标物为固体时，用天平分别精确称取标准物质(精确到0.0001g)，并用甲醇作为基体溶解定容，使溶液浓度为100 u g/mL 的单标，此溶液作为标准物质储备液。当购买的标准物质为液体时，购买的标准溶液即作为标准物质储备液。此标准物质储备液置于-18℃下冷藏，可使用一年。使用的标准物质及 CAS 号码见表1. 表1 使用的标准物质及 CAS 号 中文名称 CAS 号 分子式 沙丁胺醇 18559-94-9 特布他林半硫酸盐 23031-32-5 CHNO.1/2H，0S 盐酸莱克多巴胺 90274-24-1 CHNO，.HCl 盐酸克仑特罗 21898-19-1 CHC1，N，0.HC1 克伦特罗-D， 129138-58-5 CHD，C1，N，0 沙丁胺醇-D3 1219798-60-3 C13H18D：NO 注标准品：纯度大于 98% 4.分析步骤 4.1试样提取 称取5g(精确至0.01g)经捣碎的样品于50mL离心管中，加入8mL 乙酸钠缓冲液，充分混匀，再加入12.5Lβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，混匀后，37℃水浴水解 12h。 添加1 u g/mL 内标工作液20uL于待测样品中，加标，加盖置于水平振荡器振荡15min，离心10min (4000r/min)， 取4mL上清液加入 0.1mol/L 高氯酸溶液 5mL，混合均匀，用高氯酸调节pH值到1±0.3。4000r/min 离心10min 后，将全部上清液转移到 50mL 离心管中，用 10mol/L的氢氧化钠溶液调节 pH 值到11.加入10mL饱和氯化钠溶液和10mL异丙醇-乙酸乙酯(6+4)混合溶液，充分提取， 在4000r/min 下离心 10min。 转移全部有机相，在40℃下用氮气将其吹干。加入 1mL超纯水，超声混匀，使残渣充分溶解后备用。 4.2 净化 预淋洗：乙酸：甲醇(1：9)3mL预淋洗。 活化：3mL甲醇活化后保证甲醇在柱中未完全流干。 上样： 将上述残渣溶液上柱 淋洗：3mL水林洗，完全抽干。 洗脱：用3mL的乙酸：甲醇(1：9)洗脱固相萃取柱，彻底抽干，收集洗脱液，40℃N2吹干，再准确加入1mL 0.1%甲酸水：甲醇(95：5)复溶。超声混匀。将溶液用 0.2 m有机相滤膜过滤后供液相色谱串联质谱测定。 4.3 标准曲线制作 混合标准物质储备液(1ug/mL)：根据标准物质储备液单标的含量，精确移取11种标准物质储备液，并用甲醇定容。使混合标准物质储备液中每种标准物质的浓度均为 1ug/mL。此溶液置于-18℃下冷藏，可以放置1个月。 混合内标标准物质储备液(1ug/mL)：根据内标标准物质储备液单标的含量，精确移取2种内标标准物质储备液，并用甲醇定容。使混合内标标准物质储备液中每种内标标准物质 的浓度均为1ug/mL。此溶液置于-18℃下冷藏，可以放置1个月。 混合标准物质中间液(100ng/mL)：移取1ng/mL混合标准物质储备液1mL 于 10mL容量瓶中，用0.1%甲酸/水-甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到 100ng/mL溶液，备用。 混合内标标准物质中间液(100ng/mL)：移取1ug/mL混合标准物质储备液1mL于10mL容量瓶中，用0.1%甲酸/水-甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到100ng/mL溶液，备用。 分别准确移取混合标准物质中间液(100ng/mL)、混合内标标准物质中间液(100ng/mL)适量，并用0.1%甲酸/水-甲醇溶液(95+5)稀释得到以下浓度的标准工作液(见表2)，经0.2um微孔滤膜过滤，备用。 表2 标准工作液浓度 序号 1 2 3 4 5 工作液浓度ng/mL 5 10 20 30 50 混合标准物质中间液(100ng/mL)体积uL 50 100 200 300 500 混合内标标准物质中间液(100ng/mL)体积uL 200 定容体积mL 1 4.4 测定 1)液相仪器条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18(2. 1mm， 75mm×2Hm) 柱温：40℃ 进样量：2儿 流动相A： 0.1%甲酸水 流动相B：乙腈 泵模式：二元高压梯度 总流速：：0.3mL/min 时间程序 时间 min 单元 命令 值 1.0 泵 B.Conc 10 1.5 泵 B.Conc 25 5.0 泵 B.Conc 25 5.5 泵 B.Conc 95 6.5 泵 B.Conc 95 6.51 泵 B.Conc 10 10.00 控制器 STOP 2)质谱条件 离子源： ESI，正离子模式 扫描方式：多反应监测 监测离子：见表3 表3 被测的母离子和离子参数表 被测物名称 定性离子对(m/z) 驻留时间(msec) Q1(V) CE Q3(V) 沙丁胺醇 240.3>148.2*240.3>222.20 2020 -12-12 -18-10 -28-22 莱克多巴胺 302.4>164.2*302.4>107.1 2020 -11-11 -17-29 -15-18 特布他林 226.0>152.1*226.0>125.1* 2020 -11-11 -16-24 -13-23 克伦特罗 277.2>203.1*277.2>259.1 2020 -10-14 -17-12 -19-25 克伦特罗-D9 286.2>204.1 43 -14 -18 -19 沙丁胺醇-D3 243.1>151.1 43 -12 -19 -26 注：质谱中被测的母离子和离子参数均为使用仪器优化出的最佳条件 5.结果与分析 5.1准确度 瘦肉精的回收率见表4。 表4瘦肉精回收率数据 化合物名称 添加浓度(ug/kg) 取样量 (g) 实测值 (ug/kg) 回收率 % 沙丁胺醇 2 5 2.330 116.52% 2 2.325 116.25% 2 2.325 116.28% 4 4.407 110.18% 4 4.452 111.30% 4 4.570 114.26% 10 10.794 107.94% 10 11.176 111.76% 10 11.255 112.55% 2 1.793 89.68% 2 1.772 88.63% 2 1.985 99.23% 特布他林 4 5 3.278 81.95% 4 3.849 96.24% 4 3.276 81.92% 10 9.444 94.44% 10 8.721 87.21% 10 8.540 85.40% 莱克多巴胺 2 5 1.9986 99.93% 2 1.9504 97.52% 2 2.0948 104.74% 4 3.8164 95.41% 4 4.4228 110.57% 4 3.5014 87.54% 10 12.185 121.85% 10 8.5658 85.66% 10 9.8052 98.05% 克伦特罗 2 5 1.889 94.47% 2 1.803 90.14% 2 1.889 94.46% 4 3.886 97.14% 4 3.816 95.40% 4 3.852 96.30% 10 9.764 97.64% 10 10.063 100.63% 10 10.425 104.25% 由表可知，沙丁胺醇回收率在107.94%一116.52%之间，特布他林回收率在81.92%一99.23%之间，莱克多巴胺回收率在85.66%一121.85%之间，克伦特罗回收率在90.14%-104.25%之间。 5.2与国标方法回收率比较 表5阳离子交换柱与瘦肉精类分子印迹柱回收率数据 沙丁胺醇 特布他林 莱克多巴胺 克伦特罗 阳离子交换柱(%) 92.8~113.6 60.2~108.4 53.0~74.8 74.4~94.8 瘦肉精类分 子固相萃取柱(%) 107.94~116.52 81.92~99.23 85.66~121.85 90.14~104.25 由表可知，对于莱克多巴胺、克伦特罗和特布他林三种物质，与国标的阳离子交换柱方法比较，使用瘦肉精类分子固相萃取柱时的回收率更优。 当购买标物为固体时，用天平分别精确称取标准物质（精确到 0.0001g），并用甲醇作为 基体溶解定容，使溶液浓度为 100μg/mL 的单标，此溶液作为标准物质储备液。当购买的 标准物质为液体时，购买的标准溶液即作为标准物质储备液。此标准物质储备液置于-18℃ 下冷藏，可使用一年