发酵食品中有机酸检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.com HPLC 法结合新型复合模式色谱柱测定发酵食品中有机酸 孙薇金琦芸 赛默飞世尔科技(中国)有限公司，北京100000 关键词 发酵食品，复合模式，有机酸， Vanquish Core， Acclaim Mixed-Mode WAX-1 依据国标GB T32098-2015对生物发酵法中有机酸的分类，单羧酸和二元羧酸在发酵食品中普遍存在。本文采用赛默飞全新液相色谱Vanquish Core平台以及复合模式色谱柱对发酵食品中4种单羧酸进行分离，流动相中未添加离子对试剂，也没有使用高水相体系，配合Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱，提高了4种有机酸的分离和保留。4种有机酸在其适宜的浓度范围内线性关系良好(10-1000ug/mL， r-2=0.9999)，LOD在1.1~1.4pg/mL之间， LOQ在4~5pg/mL之间，均能满足发酵食品中单羧酸的检测要求。 1.引言 水果蔬菜及其制品中常含有丰富的有机酸，如柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸、琥珀酸、乳酸、乙酸等。发酵食品如酸奶，果醋等，在生产加工存储过程中，也会产生有机酸。另外还有一部分有机酸是作为添加剂添加到食品中的。国内分析食品中有机酸标准较多，以二元酸检测为主。对于一元羧酸的分析，甲酸、乙酸和乳酸在C18柱上分离是比较困难的，主要途径是通过高比例水相和添加离子对试剂，如何减少高比例水相及离子对试剂对色谱柱的损害，是急需方法解决的问题。 2.2.2储备液：分别精确称取四种有机酸适量，水溶解，配制储备液1000 pg/mL。 2.2.3系列标准曲线：水溶剂，配制系列标准溶液10ug/mL-1000pg/mL 2.2.4供试品：精密称取酸奶1.2g，加8mL水，振摇1min，定容到10mL，4500r/m离心10min， 过滤，取续滤液作为上机溶液。精密称取固体酵素1g，加8mL水，振摇1min，定容到10mL， 4500r/m离心10min，过滤，取续滤液作为上机溶液。 2.3色谱条件 色谱柱：Thermo Acclaim Mixed-ModeWAX-1(250mmx4.6mm， 5pm) 柱温：30℃； 样量： 10pL； 流速：0.8ml/min； 检测波长： UV210nm； 流动相：乙乙：25mmol磷酸二氢钾(磷酸调PH3.93)(40：60)，等度洗脱。 3.实验结果与讨论 3.1重复性测试 采用上述仪器分析方法，4种单羧酸在20分钟内均可获得良好的色谱峰，分离效果良好。图1为四种有机酸200ppm浓度色谱图，各峰面积及保留时间RSD%值均小于0.6%，其中各化合物测试结果见表2。 图1.4种有机酸混标(浓度为各200ppm) Fig .1 Standard mixture of 4 organic acids (Each at 200ppm) 3.2线性范围测试 采用上述仪器分析方法，对4种有机酸进行线性范围测试，线性相关系数r2均大于0.999，线性关系良好。4种有机酸线性范围、线性相关系数、LOD(S/N>3)及LOQ(S/N>10)结果见表2，化合物线性方程图见图2。 表2.4种化合物的线性范围、线性相关系数及LOD、LOQ、RSD Table2. 4 Linear Ranges， correlation coefficients， LOD， LOQ， RSDof 4 compounds 化合物 线性范围 相关系数 LOD LOQ RSD% (ug/mL) (r) (ug/mL) (ug/mL) (n=6) 乙酸 10-1000 1.0000 1.25 5 0.60 丁酸 10-1000 0.9998 1.05 4 0.27 乳酸 10-1000 1.0000 1.12 5 0.51 甲酸 10-1000 1.0000 1.33 5 0.56 图2.4种化合物线性方程图 Fig.2 Linear Ranges， Linear equations and correlation coefficients 3.3样品测试 对市售的发酵酸奶和固体酵素饮料进行有机酸检测，乳酸均检出，其他干扰物与乳酸及其他几种有机酸位置互不影响。 图3.发酵酸奶样品色谱图 Fig.3 Chromatogram of fermented yoghurt sample 图4.固体酵素饮料样品色谱图 Fig.3 Chromatogram of solid enzyme beverage sample thermoscientific 在开发方法的过程中，按照色谱柱的说明书配制磷酸盐缓冲液时，考察了焦磷酸钠减少管路体系中金属离子的干扰问题，发现流动相种添加或不添加焦磷酸钠对一元羧酸的分析几乎没有影响，如果在实验分析过程中，出现有机酸拖尾或者管路中金属离子干扰分析的情况下，可以在流动相中适当添加焦磷酸钠。此外，在方法开发过程中，也摸索了反相色谱柱进行测试，甲酸乙酸乳酸峰出峰时间比较接近，同时样品基质存在干扰峰，所以最终本方法还是基于WAX-1色谱柱进行开发。在发酵食品中，一元羧酸普遍存在，除了方法中检测的四种有机酸，此条件下还可以同时检测丙酮酸，出峰时间较晚，约25min附近。 ( [1 ] 王柳，吕嘉，沈文 HPLC法分析酸奶发酵过程中的有机酸，食品工业，2 0 14. ) ( l张梦梅，刘芳，胡凯弟，胡露，刘金霞，张美佳，刘书亮酵素食品微生物指标与主要功效酶及有机酸分析，食品发酵与工业杂志，2018. ) ( Thermo Scientific Acclaim Mixed-Mode WAX-1 column total control of selectivi t y， LPN1899 10M 02/07. ) ( 14 Thermo Scientific Product Manual for Acclaim Mixed- M ode WAX-1 column， D ocument No.065165-03 2009. ) Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱独特的复合模式键合相，同时兼具反相和弱阴离子交换两种交换模式，此方法报告中4种有机酸主要通过离子交换模式进行保留，相比C18而言，具有不需要高水相，不需要添加离子对试剂的优势。方法重复性良好，4种有机酸在10-1000ppm范围内线性关系良好，高浓度有机酸峰形尖锐对称。本方法非常适合用于发酵食品中单羧酸的检测。 Acclaim Mixed-Mode系列色谱柱详细信息介绍如下： AcclaimTrinityP1 AcclaimTrinityP2 PAcclaimNMixed-ModeWCX-1 AcclaimMixed-Mode WAX-1 AcclaimMixed-ModeHILIC-1 Functionality ·Reversed-phase· Weak anionexchange·Strong cationexchange · HILIC· Strong anionexchange·Weak cationexchange ·Reversed-phase· Weak cationexchange ·Reversed-phase· Weak anionexchange ·Reversed-phase· HILIC USP type - L85 L78 Startingmaterial Ultrapure silica Particle shape Spherical Particle sizes 3pm 3 pm 3pm5 pm 3 um5 pm 3 pm5pm Average porediameter 300 A 300A 120 A 120A 120A Surface area 100 m/g 100 m/g 300m/g 300 m/g 300 m/g pH range 2.5-7.5 2.5-7.5 2.5-7.5 2.5-7.5 2.5-7.5 赛默飞 官方微信 ( 仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎2020Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有 权 利。所有商标 均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及 其 子公司的资产，除非另有指明。 ) 在开发方法的过程中，按照色谱柱的说明书配制磷酸盐缓冲液时，考察了焦磷酸钠减少管路体系中金属离子的干扰问题，发现流动相种添加或不添加焦磷酸钠对一元羧酸的分析几乎没有影响，如果在实验分析过程中，出现有机酸拖尾或者管路中金属离子干扰分析的情况下，可以在流动相中适当添加焦磷酸钠。此外，在方法开发过程中，也摸索了反相色谱柱进行测试，甲酸乙酸乳酸峰出峰时间比较接近，同时样品基质存在干扰峰，所以最终本方法还是基于WAX-1色谱柱进行开发。在发酵食品中，一元羧酸普遍存在，除了方法中检测的四种有机酸，此条件下还可以同时检测丙酮酸，出峰时间较晚，约25min附近