合成肽中杂质检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent生物制药 Trusted Answers 合成肽及其杂质的分析 将质谱兼容的流动相与 Agilent AdvanceBio PeptidePlus 色谱柱配合使用 Andrew Coffey 和 Veronica Qin 安捷伦科技有限公司 通常情况下，使用 C18 反相 HPLC 色谱柱和三氟乙酸 (TFA)作为离子对试剂的流动相，对多肽进行色谱分离，并使用 UV 进行检测。虽然 TFA 提供了更高的分离度，但是它可能会抑制质谱(MS)信号。甲酸 (FA) 是用于 MS 检测的首选流动相离子对试剂，但它会导致许多传统 C18 柱无法达到最佳分离效果。本应用简报介绍了使用Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱和 MS 兼容的 FA (云为流动相改性剂)分离合成多肽杂质。 前言 大多数多肽药物通过固相多肽合成法进行生产。合成多肽相关杂质可能来自原辅料、生产过程，或者在生产或储存过程中因降解而产生。传统上，使用反相色谱柱实现多肽分离，并以三氟乙酸 (TFA) 作为流动相改性剂， UV 作为检测器。然而，TFA 会抑制质谱(MS)信号，因此它并不是MS的理想选择。 通过 LC/MS 方法鉴定杂质峰时，甲酸(FA)是首选的流动相改性剂，但它会导致传统 C18柱无法达到最佳分离效果。 TFA (pKa ~0.23)可以降低 pH值，使固定相表面残留的(未完全烷基化或封端)硅醇基位点质子化，从而没有负电荷与带正电荷的肽相互作用，有利于形成良好的峰形。此外， TFA 阴离子与带正电荷的肽形成离子对，增强了疏水性并延长了保留时间。与此相反， FA (pKa =3.77)的酸性比 TFA弱，无法将 pH降低到使所有硅醇基位点质子化的程度，因此硅醇基与多肽之间的相互作用不会被完全掩盖。与使用TFA 作为流动相改性剂相比， FA 会导致峰展宽、拖尾增加、整体分离度以及峰容量降低。 与传统的 C18柱相比， Agilent AdvanceBioPeptide Plus 固定相具有杂化且带正电荷的表面，使用 FA 作为改性剂时也可以提供更好的峰形和分离效果。本简报介绍了一种使用 FA 作为流动相改性剂来分离合成肽杂质的液相色谱方法，此方法可以使用UV或MS检测器，因此更容易在 LC/UV 和 LC/MS 之间进行方法转移。 LC/MS 和LC/MS/MS 均可用于鉴定样品(合成比伐卢定，图1)中的某些杂质。 比伐卢定是一种含有20个氨基酸的合成肽，能够可逆性地抑制凝血酶。 合成肽的质量控制要求对杂质进行检测和鉴定。比伐卢定氨基酸序列 (FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL) 的单一同位素质量为2178.9858 Da。 H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH 图1.合成比伐卢定的氨基酸序列 表1.预测的比伐卢定MS/MS碎裂模式 序列 编号 b y 编号(+1) F 1 148.076 2179.993 20 P 2 245.129 2032.925 19 R 3 401.230 1935.872 18 P 4 498.282 1779.771 17 G 5 555.304 1682.718 16 G 6 612.325 1625.697 15 G 7 669.347 1568.675 14 G 8 726.368 1511.654 13 N 9 840.411 1454.632 12 G 10 897.433 1340.589 11 D 11 1012.460 1283.568 10 F 12 1159.528 1168.541 9 E 13 1288.571 1021.472 8 E 14 1417.613 892.430 7 1 15 1530.697 763.387 6 P 16 1627.750 650.303 5 E 17 1756.793 553.250 4 E 18 1885.835 424.208 3 Y 19 2048.899 295.165 2 L 20 2161.983 132.102 1 因此，使用 LC/MS可以准确测定肽的质量，但是使用 MS/MS 分析还可以通过预测的碎裂模式来确定序列，如表1所示。 试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC 级或更高等级。 样品前处理 陈化的合成多肽三氟醋酸比伐卢定水合物购自Selleckchem，与0.1%甲酸水溶液复溶至1 mg/mL。 仪器 对于 HPLC 实验， 使用 Agilent 1290 InfinityLC， 其中包括： Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) Agilent 1290 Infinity 自动进样器(G4226A) Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) Agilent 1260 Infinity Ⅱl 二极管阵列检测器 (DAD) (G7115A) 对于 LC/MS实验，将相同的1290 InfinityLC 配置与 Agilent 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF 检测器配合使用。 数据处理 使用 Agilent OpenLab 2.2 CDS处理LC/UV 数据。使用 Agilent MassHunterBioConfirm B.08.00 软件处理 LC/MS 数据。MS/MS 谱图用于确认合成肽及其杂质的身份。 HPLC 条件 色谱柱 Agilent AdvanceBio Peptide Plus， 2.1×150mm (部件号695775-949) 流动相 A) 0.1%甲酸水溶液 B)0.1%甲酸乙腈溶液 梯度 0 min： 17% B 2min： 17%B 22 min： 37%B 24 min： 95%B 26 min： 95%B 26.1min： 17%B 后运行时间 5 min 流速 0.4 mL/min 柱温 60°℃ 进样量 5pL(UV)；1 pL (MS) 参数 值 仪器 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 离子源 双安捷伦喷射流 干燥气温度 350C 干燥气流速 10 L/min 雾化器气体 30 psi 鞘气温度 275°C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 4000V 喷嘴电压 0V 碎裂电压 125V 锥孔电压 65V Oct 1 RF Vpp 750 V 质量范围 m/z 100-1700 (MS)；m/z 50-1700 (MS/MS) MS 扫描速率 8幅谱图/秒 MS/MS 扫描速率 3幅谱图/秒 采集模式 正离子，扩展动态范围(2GHz) 碰撞能量 3.6×(m/z)/100-4.8 总共选择了5个峰来说明联合使用 LC/MS和 LC/MS/MS的鉴定技术。 图2展示了陈化的比伐卢定多肽样品的分离谱图，其中使用 FA 作为流动相改性剂，并通过 UV 进行检测。如表2所示，LC/MS/MS 用于鉴定谱图中的几个主要杂质峰时，具有非常低的质量偏差。 常见的杂质包括缺失序列(缺少单个氨基酸)、存在未完全去除的保护基团或在去除保护基团期间发生对肽的修饰、失水以及在此特定多肽序列中 Asn 易发生脱酰胺化(可能发生在生产或储存过程中)。 图2.合成比伐卢定的 LC/UV 谱图。展示了放大的合成比伐卢定的基线区域 表2.陈化的比伐卢定多肽和主要杂质的峰鉴定 峰 质量 (Da) 峰归属 目标质量(Da) 质量偏差(ppm) 1 2049.9467 Glu 缺失 2049.9432 1.71 2 2178.9894 产品 2178.9858 1.65 3 2121.9663 Gly 缺失 2121.9644 0.90 4 2160.9764 失水 2160.9705 2.73 5 2179.9742 脱酰胺基化 2179.9698 2.02 LC/UV 色谱图的主要成分(峰2)的MS谱图如图3所示。该质谱图对应 m/z[M + 2H]2+和[M+3H]3+，解卷积后质量为2178.9894，对应比伐卢定的完整肽序列 FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL。 ×102 使用类似的方法来鉴定较早洗脱的杂质峰1。在本例中，得到了相似的质谱图(图4A)，但是解卷积之后，杂质的质量为2049.9467。质量差为-129Da， 表明该杂质只比比伐卢定少了一个谷氨酸。仔细查看 LC/MS/MS谱图，可以确定丢失的 Glu 残基的位置(图4B)。 BioConfirm 软件鉴定出 图3.主成分(峰2) 的MS 谱图 FPRPGGGGNGDFEEIPEYL(一个19个 ×102 氨基酸的序列)的b1s和y4片段， 表明该序列在17或18号位丢失一个谷氨酸。 1.2-A 质荷比(m/z) 图4.(A)杂质峰1的MS谱图。(B)杂质峰1的 MS/MS 谱图 分析杂质峰3得出的质量差为-57 Da，表明该杂质丢失一个甘氨酸(图5)。同时，杂质峰4的质量差为18，表明由于脱水丢失了一个H，0分分 (MS谱图未显示)。最后，分析杂质峰5得出的质量差为+1 Da， 表明发生了脱酰胺反应(图6A)。仔细查看该杂质的 MS/MS 数据后发现，该软件已确定位置9 的 Asn (N)已通过脱酰胺作用转化为 Asp (D)。 100011001200 1300 1400 150016001700 图 5.杂质峰3的MS谱图 ×102 A ×102 y5 图6.(A)杂质峰5的 MS谱图。(B)杂质峰5的 MS/MS谱图 ( 在本研究中，使用 A gilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱并以甲酸作为流动相 改性剂来分析合成肽及其杂质。采用的方法可以在 LC/UV 和 LC/MS 之间轻松 转移。 ) ( 1. Eggen， l. et al. Control Strategiesfor Synthetic Therapeutic PeptideAPIs Par t ⅢI： Manufacturing Process Considerations. Pharm. Technol. 2014，38(5) ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com RA.2046990741 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2020 ) 在本研究中，使用  Agilent  AdvanceBio  Peptide  Plus  色谱柱并以甲酸作为流动相改性剂来分析合成肽及其杂质。采用的方法可以在  LC/UV  和  LC/MS  之间轻松转移。