饲料和鸭肉粉中四环素类药物残留量检测方案(液相色谱仪)

使用QuEChERS 结合 HPLC-MS/MS快速测定饲料和鸭肉粉中四环素类药物残留量 作者 前言 吴翠玲，安娟 四环素类抗生素是一类人工合成或从链霉菌属微生物中提取的具有广谱抗菌活性的化合物。常用的四环素类抗生素包括土霉素、四环素、金霉素、强力霉素等，作为治疗药物被广泛用于畜禽养殖中。四环素类药物在畜牧养殖业中的滥用和不遵从停药期规定可能导致药物残留，从而经过食物链进入人体，沉积于人体骨骼及牙组织内，与新形成的骨骼和牙齿中所沉积的钙相结合，导致牙齿呈持久黄色，俗称“四环素牙”；四环素类药物还可能在人体肝组织中富集造成肝损害，引起过敏反应、二二重感染和致畸胎作用等；另外，四环素类药物残留易诱导耐药菌株，给人体健康带来隐患。 为了更好地保证人民群众食品安全，规范四环素药物使用，我国国家兽药最大残留限量标准 GB 31650-2019中规定，不同动物源食品中四环素的残留限量为100-1200 ug/kg。饲料中则不允许添加四环素类药物。农业农村部公告282号-2-2020液相色谱串联质谱法检测饲料中四环素抗生素的相关检测限为 0.01-0.1 mg/kg。本方法采用 Agilent BondElut QuEChERS 基质分散样品前处理净化技术，方法简单快速，与标准方法的固相萃取前处理相比，简单、快速，在满足标准要求的准确度和灵敏度的基础上，大大提高了分析效率，同时降低了由于操作烦琐和时间较长而造成的药物不稳定风险。 实验部分 称取1±0.01g样品，加入5mL(饲料样品)或 3mL(鸭肉粉样品) 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine溶液中* 涡旋混匀后，加入10 mL含5%甲酸的乙腈溶液并涡旋混匀 超声提取 15 min 后，加入 Bond Elut QuEChERS兽药残留专用萃取盐包(部件号5982-0032)，混匀，于4℃5000r/min 离心10min 取6mL乙腈萃取液加入到 15 mL Bond Elut QuEChERS 分散试剂盒(部件号5982-4950)中，涡旋1 min 于4℃5000 r/min 离心10 min， 取4mL上清液于35℃下氮吹近干 用20%乙乙水定容至1 mL， 过 PES膜， 待测 Mcllvaine 缓冲液的制备：将1000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625mL 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液混合，然后用 NaOH 或 HCI 将 pH 调节至4.0±0.05) 图1.样品前处理过程 表1.色谱条件 色谱柱 Agilent Poroshell 120 EC-C18，3.0×100mm， 2.7 pm 流动相A 含0.1%甲酸的 2 mmol/L乙酸铵水溶液 流动相B 含0.1%甲酸的乙腈溶液 梯度 0.0-6.0 min， 10%-40%B； 6.0-7.0 min， 40%-100%B；7.0-9.0 min， 100%B； 9.1 min， 10%B 后运行时间 2 min 流速 0.4 mL/min 表2.质谱条件 电离模式 ESI* 离子源温度 250°C 干燥气流速 7 L/min 雾化器压力 35 psi 鞘气温度 325°C 鞘气流速 11 L/min 毛细管电压 3500(+) 喷嘴电压 300V 化合物 母离子(m/z) 子离子 (m/z) 裂解电压(v) 碰撞能量(eV) 金霉素 479.15 462444 154 130130 145 1619 38 土霉素 461.15 443.1426.0154.1 13013095 81640 四环素 445.15 427.1410 125 816 多西四环素 445.1 428321 130 15 33 表4.化合物线性范围和相关系数R² 化合物名称 线性范围(ng/mL) 线性相关系数R² 土霉素(OTC) 1~1000 0.9972 金霉素 (CTC) 1~1000 0.9961 四环素(TC) 1~1000 0.9982 多西四环素(DTC) 1~1000 0.9991 本文所述方法适用于饲料和鸭肉粉中匹环素类药物残留量的检测。通过所得数据推算金霉素、土霉素、四环素和多西四环素在饲料样品中的定量限均为 10 pg/kg， 检测限分别为1、1、5和5pg/kg； 在鸭肉粉样品中的定量限均为 10 pg/kg，检测限分别为2、1、1和5 ug/kg。溶剂标准曲线在 1-1000 ng/mL 范围内表现出良好的线性，R²>0.99(见表4)。金霉素、土霉素、四环素和多西四环素在饲料样品中的平均回收率分别为72.4%-98.6%、76.9%-92.2%、72.1%-90.7%和86.6%-117.7%，且RSD≤ 10.6%；在鸭肉粉样品中的平均回收率分别为 63.9%-104.3%、61.5%-95.7%、67.9%-77.1%和63.5%-111.2%，且RSD≤ 9.5%(回收率均用基质标进行校正)，如表5所示。 利用20 pg/kg 基质标样的峰面积除以 20 pg/kg 溶剂标样的峰面积的百分比，考察四环素类药物在不同组织中基质效应。结果表明，金霉素、土霉素、四环素、多西四环素在饲料中的基质效应分别为82.4%、67.4%、63.8%和48.5%，在鸭肉粉中的基质效应分别为 39.4%、182.1%、117.2%和88.9%。 表5.在饲料和鸭肉粉基质中加标回收率和稳定性(RSD) 基质 添加浓度(ng/g) 金霉素 土霉素 四环素 多西四环素 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 饲料 10 98.6 4.5 92.2 7.7 90.7 10.6 86.6 2.8 20 84.6 8.3 76.9 5.4 72.1 5.0 91.3 2.5 50 72.4 4.3 84.7 4.7 77.6 4.6 117.7 1.7 鸭肉粉 10 104.3 9.5 95.7 8.7 77.1 8.0 111.2 8.1 20 63.9 4.5 64.9 1.8 67.9 7.6 63.5 4.9 50 74.6 4.0 61.5 1.5 70.6 6.4 102.2 4.8 图3.饲料基质中四环素标样(蓝色)在不同基质中的 50 pg/kg 的加标样品(红色)、20 ng/mL基质标样(绿色)、空白基质样品(黑色)的 MRM 色谱图 金霉素基质标样20 ng/mL 四环素添加 50 ng/g 图4.鸭肉粉基质中四环素标样(蓝色)在不同基质中的 50 pg/kg 的加标样品(红色)、20 ng/mL基质标样(绿色)、空白基质样品(黑色)的 MRM色谱图 本文采用 QuEChERS 快速基质分散净化技术结合 HPLC-MS/MS建立了一种定量测定饲料和鸭肉粉中四环素类药物残留量的方法。该方法使用安捷伦含有50 mg PSA， 150 mg C18 EC 和 900mg NazSO的 15mL分散试剂盒，可有效去除饲料中的基质干扰，其优点在于分析快速且操作简单。通过基质标校正即可实现对饲料和鸭肉粉中4种四环素类药物快速定量分析的目的。从样品基质空白添加回收和基质标 MRM谱图(见图3，图4)可知，4种目标分析均无干扰，可以准确定量。 消耗品 部件号 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱，3.0×150 mm， 2.7 pm 693975-302 Agilent Bond Elut QuEChERS 兽药残留专用萃取盐包 5982-0032 Agilent Bond Elut QuEChERS 15 mL基质分散净化试剂盒 5982-4950 Agilent Captiva 针头过滤器， PES， 0.2 pm， 13mm 5190-5273 www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2021 ) 5994-3615ZHCN 本文采用 QuEChERS 快速基质分散净化技术结合 HPLC-MS/MS 建立了一种定量测定饲料和鸭肉粉中四环素类药物残留量的方法。该方法使用安捷伦含有 50 mg PSA, 150 mg C18 EC 和 900 mg Na2SO4 的 15 mL 分散试剂盒，可有效去除饲料中的基质干扰，其优点在于分析快速且操作简单。通过基质标校正即可实现对饲料和鸭肉粉中 4 种四环素类药物快速定量分析的目的。从样品基质空白添加回收和基质标 MRM 谱图可知，4 种目标分析均无干扰，可以准确定量