调味料中单糖、二糖和寡糖检测方案(液相色谱仪)

高效液相色谱分析仪 NexeraTM lite， ELSD-LT ⅢII ApplicationNNo.L593 http：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2021年1月400-650-0439 前言 已经阐明，糖类与糖尿病、肥胖、过敏、痴呆等健康问题的发生有关。众所周知，限制糖类的摄入是一种有效预防和治疗这些病症的方式。然而，在限制糖类摄入方面，调味料却经常被忽略。实际上，在某些调味料中会含有较多的糖分。 除了糖分以外，这些调味品还含有大量的盐分。对于盐分较高的样品，使用示差折光检测器(RID)、蒸发光散射检测器 (ELSD)等选择性较低的检测器进行糖的定量分析，容易受到基质的干扰。本文中，在预处理操作中对实际样品进行脱盐处理以除去干扰分析的盐分，从而提高了定量的准确性。 本文介绍了应用亲水相互相用色谱法(HILIC) 对15种糖组分进行分离，并通过 ELSD-LT Ⅲ进行糖类检测。此外，还对6种市售调味料中的糖分进行了的定量分析。 单糖、二糖和寡糖15种组分混合标准溶液的测定 从单糖到四糖的寡糖15种目标组分见表1。图1所示为15种糖组分的标准溶液(由70%乙腈水溶液配制，浓度为100 mg/L)色谱图，表2所示为分析条件。使用梯度洗脱法，可以在约40分钟内洗脱15种组分。由于半乳糖和葡萄糖是同分异异体，通常在LC分析中会发生共流出。但是，如果按照本文中的分析条件，则可将它们分离。 表1目标组分 化合物 糖类 1 核糖 2 阿拉伯糖 3 木糖 4 果糖 单糖 5 甘露糖 6 半乳糖 7 葡萄糖 8 乳果糖 9 蔗糖 10 乳糖 二糖 11 麦芽糖 12 异麦芽糖 13 棉子糖 三糖 14 麦芽三糖 15 水苏糖 四糖 图115种糖组分混合标准溶液(100 mg/L)的色谱图 系统 Nexera lite 色谱柱 ：Shodex HILIC pak VG-50 4E (250 mm×4.6 mm 内径， 5 um) 流速 ：1.0mL/min 流动相 ：A)水 B)乙青 时间程序 ：88%B (0-12min)→83.5%B (25min) →60%B(40-45min) →88%B (45.10-55min) 柱温 ：45℃ 进样量 ： 10pL 样品瓶 ： SHIMADZU LabTotalTM 用于 LC 1.5mL， 玻璃* 检测(ELSD) ： ELSD-LT III 增益 ：宽 过滤器 ：4秒 漂移管温度 ：40°℃ 雾化气 ：N 气压 ：350kPa 表3所示为 100 mg/L标准溶液重复分析6次的保留时间和峰面积重现性(%RSD)。保留时间和面积重现性的结果分别在0.2%、6.3%以下(表3)。 表3重现性结果 (%RSD， n= 6) 化合物 保留时间 峰面积 1 核糖 0.09 6.22 2 阿拉伯糖 0.06 5.23 3 木糖 0.04 5.44 4 果糖 0.04 6.12 5 甘露糖 0.00 4.66 6 半乳糖 0.15 5.71 7 葡萄糖 0.09 6.04 8 乳果糖 0.07 4.70 9 蔗糖 0.04 3.68 10 乳糖 0.05 3.80 11 麦芽糖 0.05 3.18 12 异麦芽糖 0.04 2.59 13 棉子糖 0.02 1.22 14 麦芽三糖 0.02 1.15 15 水苏糖 0.02 2.99 I标准曲线 对15种糖类目标组分创建标准曲线，所有组分的相关系数平方r均在0.998以上，且线性良好。另外，由于 ELSD 检测器上物质的量与散射光的强度呈指数关系，因此以响应强度和浓度的对数为坐标轴绘制标准曲线。图2所示为葡萄糖和蔗糖的标准曲线，表4为所有糖类目标组分的标准曲线浓度范围和相关系数。 图2标准曲线 表4标准曲线浓度范围和相关系数(r) 化合物 浓度范围(mg/L) r 1 核糖 10-80 0.9982 2 阿拉伯糖 10-80 0.9991 3 木糖 10-80 0.9988 4 果糖 100-1000 0.9980 5 甘露糖 10-100 0.9991 6 半乳糖 40-400 0.9992 7 葡萄糖 100-1000 0.9988 8 乳果糖 10-80 0.9986 9 蔗糖 40-400 0.9993 10 乳糖 10-80 0.9998 11 麦芽糖 10-400 0.9991 12 异麦芽糖 10-400 0.9990 13 棉子糖 10-100 0.9993 14 麦芽三糖 10-80 0.9997 15 水苏糖 10-80 0.9999 图3所示为烧烤酱的预处理方法。称取100 mg 市售烧烤酱，用70%乙腈水溶液提取，定容至20mL。然后进行离心分离，取上清液用 0.2 um 的膜过滤器进行过滤，上机分析。色谱图如图4所示。在烧烤酱中检测到了果糖、葡萄糖和麦芽糖。 图3预处理方法(烧烤酱) mV 4 图4烧烤酱样品色谱图 牛排酱、番茄酱的分析 图5所示为牛排酱和番茄酱的预处理方法。分别称取100mg 市售牛排酱和番茄酱，用70%乙腈水溶液提取，分别定容至图5所示的容量。接着，进行离心分离，得到上清液。由于这些样品中含有较高盐分，会干扰到糖类的定量测定，使用阳离子交换柱进行了脱盐处理。使用S*Pure Pte Ltd 生产的 Maxi-CleanTMSPE 0.5 mL IC-H(H+型)作为离子交换柱。操作方法为，将获得的上清液加载到利用超纯水活化的离子交换柱中，弃去2 mL初始洗脱液，使用0.2um 膜过滤器对其余洗脱液进行过滤，上机分析。 图6和图7分别为牛排酱和番茄酱样品的色谱图。在大约30分钟检测到的峰是盐。通过用IC-H脱盐，能够对掩埋在盐中的少量麦芽糖和异麦芽糖进行定量分析。 图5预处理方法(牛排酱、番茄酱) 图6牛排酱样品色谱图 图7番茄酱样品色谱图 酱油、黑醋的分析 图8所示为酱油和黑醋的预处理方法。称取各100 uL市售酱油和黑醋，用70%乙腈水溶液提取，定容至5mL。与牛排酱等一样，这些样品都含有高浓度的盐分，因此用 IC-H 进行了脱盐处理。脱盐后的处理方法与前项相同。 图9和图10分别为酱油和黑醋样品的色谱图。通过使用IC-H脱盐，证实这些样品中不存在被高浓度的盐所覆盖的糖分。此外，半乳糖和葡萄糖共存于酱油中，可以对其进行分离和定量。 图8预处理方法(酱油、黑醋) 图9酱油样品色谱图 图10黑醋样品色谱图 |加标回收试验 使用番茄酱进行了加标回收试验。将果糖、葡萄糖和蔗糖添加至100mg番茄酱中，分别添加至浓度为2000mg/100g(样品溶液中的浓度均为100mg/L)， 按照图5的预处理方法同时对5个样品进行了预处理。加标回收试验结果如表5所示。 表5加标回收试验结果 (n=5) N 回收率(%) 果糖 葡萄糖 蔗糖 82.0 80.0 93.3 2 92.5 91.7 99.2 3 83.2 81.5 88.1 4 88.2 80.8 94.1 5 82.8 80.3 95.3 平均值 85.8 82.9 94.0 (%RSD) (0.91) (0.64) (2.05) |黑葡萄醋的分析 图11所示为黑葡萄醋的预处理方法。称取100 uL市售黑葡萄醋，用70%乙腈水溶液提取，定容至20 mL。然后，将用0.2um 膜过滤器过滤的液体上机 HPLC 分析。 色谱图如图12所示。从黑葡萄醋中检测到了果糖和葡萄糖。 调味品100pL 70%乙腈相当于制备20 mL混匀过滤 (0.2 pm) HPLC 图11预处理方法(黑葡萄醋) 图12黑葡萄醋的色谱图 各调味料的分析结果 表6所示为各种调味料中糖的分析结果，该检测结果是经过样品预处理后的浓度。 表6各种调味料的分析结果 浓度(mg/L) 烧烤酱牛排酱番茄酱黄豆酱 黑醋 香醋 化合物 稀释比 .200 100 200 50 50 .200 2 阿拉伯糖 N.D. N.D. N.D. 21.2 18.5 N.D. 3 木糖 N.D. N.D. N.D. 12.0 N.D. N.D. 4 果糖 541.6 772.7 398.5 N.D. 116.1 757.0 5 甘露糖 N.D. 17.1 N.D. N.D N.D. N.D 6 半乳糖 N.D. N.D N.D. 95.8 N.D. N.D. 7 葡萄糖 596.6 803.9 710.1 214.9 210.2 757.0 9 蔗糖 N.D. 182.8 84.6 N.D N.D. N.D. 11 麦芽糖 56.6 22.1 31.7 N.D N.D. .N.D 12 异麦芽糖 N.D. 17.2 N.D. N.D. N.D. N.D. 14 麦芽三糖 N.D. N.D 12.5 N.D N.D. N.D 总结 应用亲水相互作用色谱法(HILIC)分析单糖、二糖和寡糖的共15种组分，并使用 ELSD-LT Ⅲ进行了检测。使用梯度洗脱法，可以在40分钟内洗脱所有组分，该方法还可以对半乳糖和葡萄糖进行分离，改变了在LC 分析中共流出的现象。 本文分析的调味料中，牛排酱、番茄酱、酱油和黑醋都含有盐分，因此，在预处理操作中使用H*型阳离子交换柱，去除了样品中的盐分。结果表明，可以对掩埋在盐中的微量糖分进行定量，并且证实了不存在被高浓度的盐覆盖的糖分。 Nexera、SHIMADZU LabTotal 是岛津制作所株式会社在日本及其他国家的商标。Maxi-Clean 是 S*Pure Pte Ltd 的商标。 岛津应用云 HILICPAK 是昭和电工株式会社的注册商标。 S*Pure Pte Ltd 制造的 Maxi-Clean SPE 0.5 mL IC-H(H*型)可以从岛津 GLC 株式会社购买。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) 使用亲水相互作用色谱法（HILIC）分析单糖、二糖和寡糖15种组分，并用蒸发光散射检测器进行了检测。该方法可以对半乳糖和葡萄糖进行分离，改变了在LC分析中共流出的现象。本文在前处理操作中使用H+型阳离子交换柱脱盐。结果表明，这种方法可以对掩埋在盐中的微量糖分进行定量，并且证实了不存在被高浓度盐覆盖的糖分。