豆粕中氨基酸检测方案(氨基酸分析仪)

Biochrom30+氨基酸分析仪氧化水解法检测豆粕A中氨基酸 一、样品前处理 1、 所用试剂 必须使用重蒸馏水或与之等质的水(电导率<10us) 1、1 双氧水，30% 1、2 甲酸，98-100% 1、 3 苯酚：须重蒸 1、4 偏重亚硫酸钠 1、5 氢氧化钠 1、6 盐酸，p=1.18g/ml 1、7 水解剂： 6mol/I的 HCL， 1L含1g苯酚： 加1g苯酚(3.3)到492mL 盐酸(3.7)中，然后用水定容至1L 1、8 20种氨基酸标准品 行号 氨基酸 行号 氨基酸 1 CYS-OX 磺基丙氨酸 TAU 牛磺酸 3 MET-SO2 蛋氨酸砜 4 ASP 天冬氨酸 5 THR 苏氨酸 6 SER 丝氨酸 7 GLU 谷氨酸 8 PRO 脯氨酸 9 GLY 甘氨酸 10 ALA 丙氨酸 11 VAL 缬氨酸 12 MET 蛋氨酸 13 ILE 异亮氨酸 14 LEU 亮氨酸 15 NLE 正亮氨酸 16 TYR 酪氨酸 17 PHE 苯丙氨酸 18 HIS 组氨酸 19 LYS 赖氨酸 20 ARG 精氨酸 2、 标样配置 氨基酸混合标准储备液：称取上述各氨基酸标样使用 PH2.2 的 Load Buffer 配置成2.5umol/L的储备液备用。 取氨基酸混合标准储备液与 PH2.2的 Load Buffer 以 1：9 的比例配置成 0.25umol/L的标准液。 3、 前处理设备 1) 天平 2) 水解管 3 量筒 4 无油真空泵 5) 干浴水解、浓缩仪 6) 移液管 7)0.45um 滤膜 4、 样品制备(参考欧盟饲料指令98/64/EC ) 1、 样品的准备 粉碎样品，通过0.5mm 的筛孔。高水分的样品粉碎前必须低于50℃鼓风干燥或者冷冻干燥。高脂肪含量的样品粉碎前必须用轻质石油(3.12)脱脂。 2、 氧化 从准备好的样品中称取约0.1~1克样品，准确到0.2mg，，于于100 ml 带螺纹盖子的瓶子中，称取的样品应该含有大约 10mg氮，水分不能超过 100mg。将瓶子放于冰水浴中冷却至0℃，加5ml氧化试剂(过甲酸苯酚)，用带弯头的玻璃刮勺混合。用空气密封膜将瓶子和刮勺一起密封，密封后一起放入0℃冰箱的冰水浴中，放置16小时。之后，从冰箱中取出，加0.84克偏重亚硫酸钠(3.4)来分解过量的氧化试剂。 3、 水解 加入25毫升盐酸-苯酚溶液，然后将反应瓶放在烘箱中，温度控制在110摄氏度，旋松帽子(防止玻璃瓶子破裂)，水解1小时。然后快速旋紧瓶塞(戴手套和护眼罩)将其继续在烘箱110摄氏度下水解23小时。 4、 加入内标并且调节 pH 值到2.20 当水解反应结束后，将反应瓶从烘箱中取出，并且打开瓶口(戴手套和护目镜)。冷却后用定量加样器准确加入15.00 克(15 毫升)正亮氨酸标准溶液，混合并且转移水解溶液到250毫升的塑料烧杯中。加入大约125毫升柠檬酸缓冲液和19毫升氢氧化钠水溶液，将实验烧杯放入到样品容器中用氢氧化钠水溶液将溶液调节到 pH 为正好2.20。 转移一部分溶液(不需要全部)到50毫升有盖子的塑料瓶中。可以马上测定或者放入冰箱等到分析的时候测定。 二、分析方法描述 (Biochrom 30+) 氨基酸分析仪分析方法参数： 1) 色谱柱： Biochrom Na 型阳离子交换树脂柱，，4.6×20cm 2) 分离程序： NO. Time Temp Buffer Pump Nin Rec Commands 1 01：00 53 3 35.0ml/h ON OFF 2 00：00 53 3 35.0ml/h ON OFF Reset 3 03：30 53 3 35.0ml/h ON OFF Load 4 15：45 53 1 35.0ml/h ON ON 5 12：00 58 2 35.0ml/h ON ON 6 02：00 58 4 35.0ml/h ON ON 7 26：00 92 4 35.0ml/h ON ON 8 04：00 92 6 35.0ml/h ON ON 9 04：00 92 3 35.0ml/h ON ON 10 14：00 53 3 40.0ml/h OFF OFF 11 02：45 53 3 35.0ml/h ON OFF End 3) 运行时间：分析时间65min 4) 反应单元温度：135℃。 5) 检测波长：570nm、440nm 同时检测。 三、外标法定量 附、豆粕A分析图谱 时间 结果表(ISTD-11-023豆粕_2020-11-19 11_01_57_024-570nm) ASTM噪音(6.88-10.95 min.)：0.1882[mV] 化合物名称 保留时间 「min1 响应 含量 T%1 含量 [ug] 峰类型 1 胱氨酸(Cys) 3.043 332.383 0.625 2.080 Ordnr 2 牛磺酸 4.987 9.128 0.033 0.110 Ordnr 3 蛋氨酸砜(Met-suD 15.353 256.583 0.000 0.000 4 天冬氨酸(Asp) 16.527 2228.307 5.014 16.678 Ordnr (强制) 5 苏氨酸(Thr) 18.543 909.933 1.818 6.047 Ordnr(强制) 6 丝氨酸(Ser) 19.867 1411.409 2.350 7.818 Ordnr(强制) 7 谷氨酸(Glu) 25.620 2846.651 8.195 27.255 Ordnr 8 甘氨酸(Gly) 29.060 1698.502 1.875 6.236 Ordnr 9 丙氨酸(Ala) 30.217 1288.865 1.927 6.408 Ordnr 10 空白试剂峰 32.113 161.519 N/A N/A Error 11 缬氨酸(Val) 32.577 981.534 1.904 6.334 Ordnr 12 异亮氨酸(Ile) 35.320 756.384 1.717 5.711 Ordnr 13 亮氨酸(Leu) 36.167 1634.451 3.2521 10.817 Ordnr 14 正亮氨酸(Nle) 37.143 1628.824 ISTD ISTD ISTD 15 酪氨酸(Tyr) 39.477 624.148 1.670 5.554 Ordnr 16 苯丙氨酸(Phe) 41.140 893.955 2.129 7.082 Ordnr 17 组氨酸(His) 51.687 505.888 1.194 3.971 Ordnr 18 赖氨酸(Lys) 57.080 1286.702 2.706 8.999 Ordnr 19 氨(Anm) 58.270： 1513.302 0.689 2.291 Ordnr 20 精氨酸(Arg) 67.133 1205.219 3.195 10.628 Ordnr 合计 40.295： 332.600 结果表(ISTD-11-023豆粕_2020-11-1911_01_57_024-440nm) 1 化合物名称 脯氨酸(Pro) 保留时间[minl 26.500 响应 574.956： 含量 % 含量 [ug] 7.940 峰 类型 Ordnr 2.387： 2 正亮氨酸(Nle) 37.144 338.337 ISTD ISTD ISTD 合计 2.387 332.600 从准备好的样品中称取约0.1~1克样品，准确到0.2mg，于100 ml带螺纹盖子的瓶子中，称取的样品应该含有大约10mg氮，水分不能超过100mg。将瓶子放于冰水浴中冷却至0℃，加5ml氧化试剂（过甲酸苯酚），用带弯头的玻璃刮勺混合。用空气密封膜将瓶子和刮勺一起密封，密封后一起放入0℃冰箱的冰水浴中，放置16小时。之后，从冰箱中取出，加0.84克偏重亚硫酸钠（3.4）来分解过量的氧化试剂。