蔗糖和精氨酸盐中物理稳定性和聚集检测方案(图像粒度粒形)

a 正交技术研究pH、蔗糖和精氨酸盐对单克隆抗体长期储存过程中物理稳定性和聚集的影响了解添加剂对治疗蛋白稳定性的影响对于获得稳定的配方至关重要。在这项工作中，作者应用了几种高通量和中通量的方法来研究模型单克隆抗体在 pH 5.0 和6.5的条件下，蔗糖，盐酸精氨酸和精氨酸谷氨酸存在的物理稳定性。在低离子强度缓冲液中，盐的加入降低了抗体的胶态和热稳定性，归因于静电相互作用的增加。精氨酸盐中谷氨酸离子的存在部分降低了离子强度增加的损伤作用。添加280mM蔗糖后，热蛋白的展开温度升高。使用浓度的精氨酸盐降低了尿素重折叠后的相对单体产率，而蔗糖对抗体重折叠有较好的作用。此外，作者还展示了12个月的长期稳定性数据，并观察了热蛋白稳定性、再折叠后的相对单体收率和单体在贮藏过程中的损失之间的相关性。贮存过程中单体的损失与某些配方中的蛋白质聚集和亚可见颗粒的形成有关。本研究表明，常用添加剂对抗体长期物理稳定性的影响可以通过正交生物物理测量来预测。 本研究中使用的单克隆抗体 PPI13 是一种人源 IgG1k，分子量为148.9 kDa， 等电点约为9.在不久的将来，关于PPI13的初级蛋白序列和其他信息将在一个在线数据库(https：//pippi-data.kemi.dtu.dk/)中提供。PPI13以无表面活性剂的散装溶液提供，蛋白质浓度为 43 g/L。采用尺寸排阻色谱(SEC)批量检测 PPI13的纯度，显示相对单体含量>97%。如前所述，在25C 条件下，用广泛透析交换缓冲液至10mM组氨酸/组氨酸盐酸盐， pH分别为5.0、5.75和6.5采用Nanodrop 2000紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific， Wilmington， DE)测量 PPI13 在280 nm 处的吸收，并用蛋白消光系数计算蛋白浓度。在组氨酸缓冲液中分别制备蔗糖、ArgHCI、ArgGlu、胍盐酸盐(GuHCI)和 nacld4 添加剂的原液，并将其添加到透析蛋白溶液中。所有化学品都是高纯度等级的，并从 Sigma Aldrich (Steinheim，德国)、VWRInternational (Darmstadt， 德国)或 Fisher Scientific (Schwerte，德国)购买。来自 arium@系统(Sartorius Lab Instruments GmbH， Goettingen， Germany)的超纯水用于制备所有溶液。 长期稳定实验 分别用缓冲液(或缓冲液加添加剂)中蛋白齐度为 5 g/L 的 PPI13样品经过 0.22 mmol 醋酸纤维素过滤器的无菌过滤，无菌填充到 DIN2RI型玻璃瓶(MGlas AG， Munnerstadt，德国)，用氟 rotec@涂层橡胶氯丁基塞压接(West Pharmaceutical Services)。并储存在4C和25C所需的时间。三个不同的小瓶被用来分析每个条件和时间 热蛋白的 PPI13 在不同 pH值(a)和添加剂对热演变的影响在酸碱 5.0(d)和6.5(g)的影响。温度对表面的水力半径 Rh PPI13 在不同 pH 值(b)和添加剂对 Rh 在加热的影响酸碱 5.0 (e) 和6.5(h)，温度对多余的散射效果不同 pH (c)下的 PPI13配方和添加剂对 pH 5.0 (f)和 pH6.5(i)加热过程中过量散射的影响。在 a、c、d、f、g和i中，数据点密度降低以提高清晰度。所有样品中 PPI13的浓度均为5 g/L。 pH Additive From nanoDSF From DLS IP1.°C IP2，C Tagg，℃ kp (mL/G) Do(x10-07cm²/s) 5.0 No 58.20±0.05 80.17±0.07 78.1±0.3 34.2±3.8 4.69±0.08 280 mM sucrose 59.32±0.06 81.04±0.05 78.9±0.1 17.1±2.1 4.15±0.09 140 mM ArgHCl 55.43±0.06 76.99±0.03 60.8±0.9 13.9±0.3 4.48±0.02 70 mM ArgGlu 59.70±0.09 80.37±0.01 73.3 ±0.2 -11.1±0.9 4.48±0.03 6.5 No 64.33±0.10 80.11±0.04 76.7±0.4 27.3±1.5 5.01±0.03 280 mM sucrose 65.86±0.11 81.24±0.03 77.4±0.4 10.7±0.8 4.62±0.04 140 mM ArgHCI 62.25±0.06 78.97±0.04 73.3±0.5 15.7±0.7 4.55±0.02 70 mM ArgGlu 63.84±0.02 80.36±0.01 74.1±0.5 -16.6±1.8 4.46±0.06 PPI13 在 pH为5.0和6.5的10mM组氨酸缓冲液中的稳定性指示参数。数值为三次重复的平均值，误差为标准差。 + 280 mM Sucrose▲+140 mM ArgHCIV+70mM ArgGlu PPI13在 pH 5.0 (a)和 pH 6.5(b)无添加剂(方形)、280 mM 蔗糖(圆形)、140 mM ArgHCI(三角形上)和 70 mM ArgGlu(三角形下)的情况下相互扩散系数的浓度依赖性。数据是由三份副本叠加而成的。这些线与点呈线性拟合。 -No additive =+280 mM sucrose +140 mM ArgHCI =+70 mM ArgGlu a 0.0010 0.0010- .pH5.0 pH 6.5 Concentration of PPI13 (g/L) Concentration of PPI13 (g/L) 概述用 SAXS 获得的结果：PPI13在 pH 5.0 (a)和 pH 6.5 (b)时的 P(r)函数， pH 5.0(c)和 pH6.5(d)时的 Dmax， pH 5.0 (e)和 pH 6.5 (f)时的 Mm。 pH 5.0 pH 6.5 50Sucrose 50- Sucrose 0 50 100 150 0 50 100 150 Additive concentration (mM) Additive concentration (mM) -Arg/Glu Ho -Arg H8 --Glu HB -Glu Hy -Arg HB +-Arg Hy 蛋白质添加剂饱和转移放大因素(AFSTD)测量单个原子的各种添加剂添加到 PPI13 pH 值5.0(左列)和6.5(右列)，蔗糖(a和b)， ArgHCI (c 和 d)和 ArgGlu (e 和f)。图下面的标签指定的单个原子 AFSTD 测量，插图显示了添加分子化化学结构，用于原子的匹配标记。 (a) 天然和1折4叠. 2PP分I5钟1.的30 (在b峰 )值1和0的 被p确 条Hm件 定M下6为 .5二组，(聚氨用c酸9)体 M条件，p下使H尿， 素在用5重不 .新添S加02E 折8C下叠0 的 m PM耦S 合EP蔗CI糖到、多 11色4角在30度图蛋 。白m光M散在时 一，A射个r(单 gH数独PC据的PI实I 未验或显 中13的7示0)相 对m。M在单 体A rp产g量GHl和u可溶性蛋白 产量。b和c中的值为三次重复的平均值，误差棒为标准差。 a b After 12 months at 25 °C 102 oEoco c ooo 添加剂对贮存12个月后可溶 PPI13的单体回收和损失的影响。(a) pH 5.0下存储25C， (b)pH 6.5下存储25C， (C) pH 5.0下存储4C， (d) pH 6.5下存储 4C。 研究了 pH 和添加剂对 PPI13在25C下储存12个月的亚可见粒子的影响。 在这项研究中，我我采用正交高、中通量技术来探讨280nM 蔗糖、140mMArgHCI 和70mMArgGlu 对一种名为 PPI13的单克隆抗体的稳定性的影响。我们在各种参数之间找到 了良好的一致性，表明在低离子强度条件下，蔗糖稳定了蛋白质，而在这种浓度下的 arginine盐在 pH 5.0 和6.5之间降低了胶体蛋白的稳定性。这种减少可以通过离子强度的增加和蛋白质单体之间的静电斥量来解释，-一旦 arginine 盐的离子与蛋白质的表面结合，就像我们的STD-NMR 实验一样。我们还进行了长期稳定性研究，以验证快速生物物理表征的观察。与长期稳定数据相比较的2个参数是第一个热的变点点的温度，在等温还原后，相对单体产生的温度。PPI13在较低温度下展开的配方，具有低胶体稳定性，是在25摄氏度后12个月储存后形成的大量可见颗粒的配方。我们的工作在两个方面都很重要。首先，它表明了许多生物物理技术所表示的 PPI13公式 低物理稳定性也是长期储存中蛋白质聚集的配方。第二，我们表明，arginine 盐是否会抑制或促进聚合高度依赖于其他溶液参数，如解决方案的起始离子强度。虽然精氨酸无疑能在短间隔疏水相互作用的配方中带来好处(例如：在高蛋白浓度下，或者在有长期静电排斥的情况下，精氨酸盐对蛋白质胶体的稳定性有一种有害的影响，在蛋白质配方中，静电斥力对抑制蛋白质聚集至关重要。在低离子强度下的稀蛋白溶液中。 了解添加剂对治疗蛋白稳定性的影响对于获得稳定的配方至关重要。在这项工作中，作者应用了几种高通量和中通量的方法来研究模型单克隆抗体在pH 5.0和6.5的条件下，蔗糖，盐酸精氨酸和精氨酸谷氨酸存在的物理稳定性。在低离子强度缓冲液中，盐的加入降低了抗体的胶态和热稳定性，归因于静电相互作用的增加。精氨酸盐中谷氨酸离子的存在部分降低了离子强度增加的损伤作用。添加280mM蔗糖后，热蛋白的展开温度升高。使用浓度的精氨酸盐降低了尿素重折叠后的相对单体产率，而蔗糖对抗体重折叠有较好的作用。此外，作者还展示了12个月的长期稳定性数据，并观察了热蛋白稳定性、再折叠后的相对单体收率和单体在贮藏过程中的损失之间的相关性。贮存过程中单体的损失与某些配方中的蛋白质聚集和亚可见颗粒的形成有关。本研究表明，常用添加剂对抗体长期物理稳定性的影响可以通过正交生物物理测量来预测。 本研究中使用的单克隆抗体PPI13是一种人源IgG1k，分子量为148.9 kDa，等电点约为9。在不久的将来，关于PPI13的初级蛋白序列和其他信息将在一个在线数据库(https://pippi-data.kemi.dtu.dk/)中提供。PPI13以无表面活性剂的散装溶液提供，蛋白质浓度为43 g/L。采用尺寸排阻色谱(SEC)批量检测PPI13的纯度，显示相对单体含量>97%。如前所述，在25C条件下，用广泛透析交换缓冲液至10 mM组氨酸/组氨酸盐酸盐，pH分别为5.0、5.75和6.5采用Nanodrop 2000紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE)测量PPI13在280 nm处的吸收，并用蛋白消光系数计算蛋白浓度。在组氨酸缓冲液中分别制备蔗糖、ArgHCl、ArgGlu、胍盐酸盐(GuHCl)和nacld4添加剂的原液，并将其添加到透析蛋白溶液中。所有化学品都是高纯度等级的，并从Sigma Aldrich (Steinheim，德国)、VWR International (Darmstadt，德国)或Fisher Scientific (Schwerte，德国)购买。来自arium®系统(Sartorius Lab Instruments GmbH, Goettingen, Germany)的超纯水用于制备所有溶液。 长期稳定实验分别用缓冲液(或缓冲液加添加剂)中蛋白浓度为5 g/L的PPI13样品经过0.22 mmol醋酸纤维素过滤器的无菌过滤，无菌填充到DIN2R I型玻璃瓶(MGlas AG, Münnerstadt，德国)，用氟rotec®涂层橡胶氯丁基塞压接(West Pharmaceutical Services)。并储存在4C和25C所需的时间。三个不同的小瓶被用来分析每个条件和时间