食品中黄曲霉毒素B1检测方案(生物安全柜)

用丁根 司发酒 BTT7的 此检测方法的实验原理是：试样中的黄曲毒素 B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板示的包被抗原结合，加人酶标记物和底；物后显色，与标准比较测定含量。 .一、实验中所需要的仪器： 1、小型粉碎机。 2、电动振荡器。3.1酶标仪：内置490 nm滤光片。4、恒温水浴锅。 5、恒温培养箱。 6、酶标微孔板。 7.微量加样器及配套吸头。 二、实验室中需要配置的试剂 1、抗黄曲毒毒素B1 单克隆抗体，由卫生部食品卫生监督检验所进行质量控制。 2、人工抗原： AFB1一牛血清白蛋白结合物。 3.黄曲由毒素B1标准溶液：用甲醇将黄曲毒毒素B1配制成1mg/mL溶液，再用甲醇非PBS溶液(20十80)稀释至约 1o pg/mL，紫外分光光度计测定此溶液最大吸收峰的光密度值，代入式(1)计算算： ......① E 式中： 一x-该溶液中黄曲奇毒素B1的浓度，单位为微克每毫升(pg/mL)i A一测得的光密度值； M一一曲奇毒素B1的分子量，312 E一摩尔消光系数， 21 800f一使用仪器的校正因素。 ，根据计算将该溶液配制成1opg/mL标准溶液，检测时，用甲醇一PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。 4、三氯甲烷 甲醇。 石油醚. 牛血清白蛋白(BSA)。 8邻苯二胺(OPD).))。 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG。 碳酸钠。 碳酸氢钠。 磷酸二氢钾甲。 磷酸氢二钠 氯化钠. 氯化钾， 过氧化氫(H202). 硫酸。发。 18.ELISA缓冲液如下：1)包被缓冲液(pH9.6碳酸盐缓冲液)的制备 Na2C032.93c 1.59g NaHC03 2) 加蒸馏水至1000 mL.磷酸盐缓冲液(pH7.4 PBS)的制备： KH2P04 0.2g Na2HP0412H20 2.9g NaCl 8.0g KK(CI加蒸馏水至1000 mL. 0.2g 3)洗液(PBS-T)的制备：PBS加体积分数为0.05%的吐温-20。4)抗体稀释液的制备： BSA1.0 g加 PBS-T至1 000 mL. 19底物缓冲液的制备如下： A液(0.1 mol/L柠樣酸水溶液)：柠檬酸(C6H807.H20) 21.01 g，加蒸馏水至1000mL ， B液(0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液)：Na2HP0412H20 71.6 g，加蒸馏水至1 000 mL， 20 用前按 A液十B液十蒸馏水为24.3十25.7十50的比例(体积比)配制。封闭液的制备：同抗体稀释液。 三、分析步骤 ，1、取样 试样中污染黄曲毒素高的粒一-粒可以左右测定结果，而且有毒有粒的比例小，同时分布不均匀。为避免取样带来的误差，应大量取样，并将该大量试样粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批试样的相对可靠的结果，因此采样应注意以下几点。1) 2) ：根据规定采取有代表性试样。对局部发奇变质的试样检验时，应单独取样丰。 3)每份分析测定用的试样应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至0.5 kg~1 kg，然后全部粉碎。粮食试样全部通过20目筛，混匀。花生试样全部通过10目筛，混匀。。或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等试样不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批试样可采采3份大样作试样制备及分析测定用，以观察所采试样是否具有一定的代表性。 2、提取 ，1)大米和小米(脂肪含量<3.0%)的提取 试样粉碎后过20目筛，称取20.0 g，加入250 mL具塞锥形瓶中。准确加入60 mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。静置后，用快速定性滤纸过滤mlk于50 mL烧杯中。立即取12 mL濾液(相当4.0g试样)于75 mL蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。用2.0 mL20%甲醇一PBS分三次(0.8 mL、0.7 mL.0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每升相当2.0 g试样。 2)玉米的提取(脂肪含量3.0%~5.0%]%) 试样粉碎后过20目筛，称取20.0 g，加入250 mL具塞锥形瓶中，准确加人50.0mL甲醇一水(80十20)溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。，用快速定性滤纸过滤于125 mL分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇一水溶液于50 rmL烧杯中，从中取10.0mL (相当于4.0g试样)于75 mL蒸发皿中。以下按上1)中自"65C水浴通风挥于f........"起依法操作 3)花生的提取(脂肪含量15.0%~45.0%) 试样去壳去皮粉碎后称取20.0 g，加入250 mL具塞锥形瓶中，准确加入100.0 mL 甲醇一水(55十45)溶液和30mL石油醚，盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。静 置15 min后用快速定性滤纸过滤于125 mL分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇一水溶液于100 mL烧杯中，从中取20.0 mL(相当于4.0 g试样)置于另一125 mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2 min，静置分层(如有乳化现象可滴加甲醇促使分层)，放出三氯甲烷于75 mL蒸发皿中。再加5.0 mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷一并于蒸发皿中，以下按上1) 自"65℃水浴通风挥干…起依法操作。 4)植物油的提取 用小烧杯称取4.0g试样，用20.0 mL石油醚，将试样移于125 mL分液漏斗中，用20.0 mL甲醇一水(55十45)溶液分次洗烧杯，溶液一并移于分液漏斗中(精炼油4.0g样为 s c4.525mL，直接用移液器加入分液漏斗，再加溶剂后振摇)，振摇2 min。静置分层后，放出下层甲醇一水溶液于75 mL素发皿中，再用5.0 mL甲醇一水溶液重复振摇提取次，提取液一并加人蒸发皿中，以下按上1)自"65℃水浴通风挥干"起依法操作。 5)其他食品的提取 5.1) 麦类、面粉、著干、豆类、花生、花生酱等 称取20.00 g粉碎过筛试样(面粉、花生酱不需粉碎)，置于250 mL具塞锥形瓶中，加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防防漏。振荡30 min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00 mL甲醇水溶液(相当于4g试样)置于另一125 mL分液漏斗中，加20 mL 三氯甲烷，振摇2 min，静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先，用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50 mL蒸发皿中，再加5 mL三氯甲烧于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜于65℃水浴上通风挥干，用2.干0， 用m2L.200 %mL甲醇20—%P甲B醇S一分P三B次S(分0三次.(0.8mL.0.7mL、0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g试样。 5.2)酱油、醋 称取10.00 g试样于小烧杯中，为防止提取时乳化，加 0.4 g氯化钠，移入分液漏斗中，用15 mL三氯甲烷分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中。以下按5.1)自"振摇2min，静置分层......"起依法操作，最后加入2.5 mL苯一乙脯混合液，此溶液每毫升相当于4g试样。 5.3)干酱类(包括豆豉、腐乳制品品) t 称取20.00 g研磨均匀的试样，置于250 mL具塞锥形瓶中，加人20 mL正己烷或石油醚与50 mL甲醇水溶液。振荡30 min，静置片刻，以叠成折叠式快速定性滤纸过滤，滤液静置分层后，取24 mL甲醇水层(相当8 g试样，其中包括8 g干酱类本身约含有4mL水的体积在内)置于分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，以下按5.1)自"振摇2 mihin静置分层………"起依法操作。最后加入2 mL苯一乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4g试样。 3、间接竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA) 包被微孔板：用AFB1-BSA人工抗原包被酶标板，150pL/孔，4℃过夜。抗体抗原反应：将黄曲旺毒素B1纯化单克隆抗体稀释后分别 a)与等量不同浓度的黄曲毒素 B1标准溶液用2mL试管混合振荡后，4℃静置。此液用于制作黄曲奇毒素B1标准抑制曲线。b)与等量试样提取液用2 mL试管混合振荡后，4℃静置。此液用于测定试样中黄曲毒毒素B1含量。 3)封闭：已包被的酶标板用洗液洗3次，每次3 min后，加封闭液封闭， 250 uL/孔，置37℃下1 h。1。 4)测定：酶标板洗3x3 min后，加抗体抗原反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液或 Sp2/0培养上清液作为阴性对照)130 uL/孔， 37℃， 2 h。 酶标板洗3X3 min，加酶标二抗[1：200(体积分数)]100pL/孔， 1 h， 酶标板用洗液洗5x3 min， 加底物溶液(10mg OPD)加25mL底物缓冲液加37 pL30% H202， 100pL/孔，37℃， 15min，然后加2 mol/L H2S04， 40pL/孔，以终止显色反应，酶标仪490 nm测出 OD值。 4结果计算 黄曲毒素 B1 的浓度按式(2)进行计算。 式中：c一-黄曲奇毒素B，含量，单位为纳克(ng) ，对应标准曲线按数值插入法求； V1-试样提取液的体积，单位为毫升(ml)； Y2- 滴 加 样 液 的 体 积 ， 单 位 为 毫 升 ( m timL)；D-一稀释倍数数： m一试样质量，单位为克(g)。 由于按标准曲线直接求得的黄曲奇毒素 B1 浓度(c1)的单位为纳克每毫升，而测孔中加入的试样提取的体积为 0.065 mL，所以式(2)中c= 0.065 mLXc1而V1=2 mL， V2=0，065 mL， D=2， m=4g代人式(2)，则 黄曲霉毒素B素度(ng/g)=0.065xcix2X-=ci(ng/g)0.065 所以，在对试样提取完全按本方法进行时，从标准曲线直接求得的数值 c1，即为所测试样中黄曲羊毒素B1的浓度(ng/g)。 ( 1 1 、 ] 此 检测方 法 根 据现行的 食品 安 全国家标准 G B /T 50 0 9 .22 - 2 003整理，是 国 标食品中黄曲 毒 毒素检 测 的 第二法去 。 2、黄曲 毒 素B1 (A F B 1 ) EL I S A快速 检测试 剂盒 具 有 快 速 、 简便 、 准确 和 灵敏度 高 等 优 点 ， 操作 时 间短 ， 能 最 大 限 度 地 减少 操作 误差 和 工 作 强度，目前 在 食品中中 曲毒 毒 素B1 的 检 测 中 广泛应 用 。 ) 联系人 孙庆磊 17615852702