粮食中黄曲霉毒素B1B2G1G2检测方案(液相色谱仪)

SDPTOP 黄曲霉毒素 B1B2G1G2 的 HPLC分析解决方案 前言 什么是黄曲霉毒素 黄曲霉毒素(Aflatoxins)是生长在食物及饲料中的黄曲霉和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有17种，主要是黄曲霉毒素 B1、B2、Gi、G2以及由B1和B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物 Mi、M2等。 黄曲霉毒素性质 黄曲霉毒素是一种毒性极强的物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中，以黄曲霉毒素Bi最为多见，其毒性和致癌性也最强。生产企业如果使用劣质的原料，如发霉的花生、菜籽、玉米等生产食用油，则有可能造成黄曲霉素超标。 黄曲霉毒素结构 OCH， O OCH. H H 黄曲霉毒素Gi 黄曲霉毒素 G2 图2-1四种常见的黄曲霉毒素 对于粮食及粮食加工业的危害 粮食作物含营养物质丰富，主要为蛋白质、维生素、膳食纤维、脂肪等。民以食为天，如果粮食被污染，从而以粮食为主成分的各种相关的产品，包括油及其他食品等使用已经污染的粮食作为原料，产成品也会间接受到污染，将会严重影响人们的身体健康，甚至造成危害。因此，粮食系统的安全至关重要。 粮食在生产储存过程中，特别是在一些湿热环境中时，受到环境条件的影响而产生的各种真菌毒素类化合物，可能会产生对人体有危害的黄曲霉毒素。 检测方法 目前黄曲霉毒素的衍生检测方法较多，大多数为柱前三氟乙酸衍生或柱后碘化学衍衍，但这些衍生方法由于衍生试剂配制繁琐，仪器操作复杂，越来越多的被光化学衍生所取代。与化学衍生法相比，光化学柱后衍生器具有使用操作方便，无需衍生试剂，避免有毒试剂的接触，环境友好等优点。 光化学衍生原理，是将原本荧光较弱的Bi及G装变为 B2a及 G2a，提高其荧光检测，继而提高检测灵敏度，其可能的反应式如图2-2及图2-3所示。 图2-2黄曲霉毒素G衍生前后结构式 图2-3黄曲霉毒素Bi衍生前后结构式 上海舜宇恒平科学仪器有限公司，结合 GB/T 5009.23-2006《食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》，提出了粮食及粮食加工业中黄曲霉毒素分析的全套解决方案。为粮食及粮食加工业中黄曲霉毒素检测提供了包括从前处理设备、试剂、前处理方法直至到液相色谱方法的全套分析解决方案。相关人员可参考本实验中的方法，进行粮食及粮食加工业中黄曲霉毒素的检测。 表1-1(a) 高效液相色谱系统设备标准配置清单 序号 名称 数量 1 紫外-可见检测器(选配) 1台 2 高压恒流泵 1台 3 色谱柱恒温箱(选配) 1台 4 Rheodyne 7725i高压六通进样阀 1个 5 阀支架 1个 6 W5100色谱数据工作站 1套 7 梯度混合器(选配) 1个 8 溶剂托盘 1台 9 C185um色谱柱 1支 10 荧光检测器 1台 11 AD适配器 1套 12 光化学柱后衍生器 1套 13 自动进样器(选配) 1台 14 在线脱气机(选配) 1台 表1-2主要化学试剂、标准品清单 序号 试剂 纯度 1 乙腈 色谱纯 2 甲醇 色谱纯 3 氯化钠 分析纯 4 去离子水 18.2MQ 5 黄曲霉毒素混标标准溶液 百灵威 表1-3 主要样品前处理设备 序号 名称 规格型号 备注 溶剂过滤器 1000mL 流动相过滤 2 隔膜真空泵 0.08MPa，160W 流动相过滤， GM-0.33A 3 超声清洗器 3L/6L，40/60KHz， 120W 流动相脱气， AS3120 4 高速万能粉碎机 转速大于10000r/min 实验过程中其它玻璃器皿还包括容量瓶(100mL、50mL、25mL、10mL)、具塞锥形瓶(250mL)， 移液枪(0~1000uL，0~5000uL)、移液枪枪头(1mL，5mL)、一次性PVC手套、一次性口罩、进样针、滤膜等若干。 实验方法 标准溶液配制 黄曲霉毒素混标标准储备液(100pg/L)：黄曲霉毒素混标样品(约5mL)置于 50mL容量瓶中，用甲醇定容。 黄曲霉混标标准工作液：用流动相稀释黄曲霉混标标准储备液分别配置的黄曲霉混标标准工作液。如其中Bi、Gi浓度为 20.0ug/L， 10.0pg/L， 6.0ug/L，2.0ug/L， 0.6ug/L， 0.2ug/L。而相对应 B2、G2浓度为 6.0ug/L， 3.0ug/L， 1.8ug/L， 0.6ug/L， 0.18ug/L， 0.06pg/L。 色谱条件 流动相：甲醇：乙腈：水=20：20：60(V：V：V) 色谱柱： SinoChrom ODS-BP5um4.6x200mm 流速：0.8mL/min 检测波长：激发360mm， 发射 450nm 进样量：20uL 柱温：室温 典型分离色谱图 进样分析浓度为20.0ug/L(B1、Gi)的黄曲霉毒素标准工作液，使用2.3.3中的色谱条件，结果如下图所示。 60- 图2-4 黄曲霉毒素标准溶液衍生色谱图 表2-4 衍生结果对比 未衍生 衍生 峰面积(mV·sev) 峰高(mV) 噪声(mV) 峰面积(mV.sev) 峰高(mV) 噪声(mV) G2 160.22 7.98 0.025 149.77 7.82 0.025 G 39.49 1.72 256.92 11.92 B2 752.59 30.79 711.06 30.43 Bi 295.13 9.87 982.48 34.92 使用光化学衍生器后，Bi及G的响应值较使用前明显增加。其中G峰面积和峰高增加约7倍，B峰面积和峰高增加约3.5倍。但对B2及 G2的响应值变化较小，基本可以忽略。 而对于噪声的影响，使用光化学衍生器前后，噪声基本保持不变，因此，Bi及G灵敏度能够分别提高约7倍和3.5倍。 将黄曲霉毒素标准工作溶液，按2.3.3中色谱条件进行光化学衍生后的分析，黄曲霉毒素的线性及检出限如下表所示。 表2-5线性方程 黄曲霉毒素 线性方程 线性相关系数R G2 y=22.185x-0.3282 0.99990 G y=23.547x+1.0349 0.99987 B2 y=33.410x+1.6965 0.99984 Bi y=41.875x+3.3725 0.99994 从上表可知，黄曲霉毒素光化学系统衍生效果良好， Bi、Gi浓度在0.2ug/L到20.0ug/L，B2、G2浓度在0.06ug/L到6.0ug/L线性范围内线性相关系数均大于0.999。 以3倍信噪比对应的浓度换算为仪器的检出限，以10倍信噪比对应的浓度为仪器的定量限。计算4种黄曲霉毒素的检出限及定量限，结果如下表所示。 表2-6检出限对比 黄曲霉毒素 方法检出限(ug/kg) GB/T 5009.23-2006(ug/kg) G2 0.03 0.05 Gi 0.08 0.20 B2 0.01 0.05 B1 0.03 0.20 从以上结果可知，光化学系统衍生后的黄曲霉毒素检测的灵敏度明显低于国标中的要求，完全符合定量要求。 实际样品 市场购买相关粮食，按本文中提到的方法并进行了分析，结果如下所示。 图2-5玉米羊品 表2-7玉米样品 黄曲霉毒素 浓度(ug/L) 含量(ug/kg) G2 未检出 未检出 Gi 0.08 0.08 ( 参考文献 ) ( [1]GBT 5009.23-2006《食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》 ) 第1章黄曲霉毒素Bi的HPLC分析解决方案 3.1 前言 3.1.1标准溶液配制 黄曲霉毒素(Aflatoxins)是生长在食物及饲料中的黄曲霉和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有17种，主要是黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2以及由 B1和B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物 M1、M2等。 3.1.2黄曲霉毒素 B性质及危害 黄曲霉毒素Bi是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素Bi的急性毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关，其毒性作用主要是对肝脏的损害。 粮食在生产储存过程中，，-一般以热带和亚热带等南方高温、高湿地区受污染最为严重，在天然食物中以黄曲霉毒素Bi最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素Bi是大部分食品的必检项目之一。生产企业如果使用劣质的原料，如发霉的花生、菜籽、玉米等生产食用油，则有可能造成黄曲霉素超标。 3.1.3黄曲霉毒素B1结构 图3-1黄曲霉毒素Bi 3.1.4检测方法 目前黄曲霉毒素Bi的衍生检测方法较多，大多数为柱前三氟乙酸衍生或柱后碘化学衍生，但这些衍生方法由于衍生试剂配制繁琐，仪器操作复杂，越来越多的被光化学衍生所取 代。与化学衍生法相比，光化学柱后衍生器具有使用操作方便，无需衍生试剂，避免有毒试剂的接触，环境友好等优点。 光化学衍生原理，是将原本荧光较弱的Bi转变为 B2a，提高其荧光检测，继而提高检测灵敏度，其可能的反应式如图3-2所示。 图3-2黄曲霉毒素Bi衍生前后结构式 结合 GB/T 5009.23-2006《食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》及 GB/T 5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素Bi的测定》，提出了粮食及粮食加工业中黄曲霉毒素Bi分析的全套解决方案。为粮食及粮食加工业中黄曲霉毒素B1检测提供了包括从前处理设备、试剂、前处理方法直至到液相色谱方法的全套分析解决方案。相关人员可参考本实验中的方法，进行粮食及粮食加工业中黄曲霉毒素Bi的检测。 表3-1高效液相色谱系统设备标准配置清单 序号 名称 数量 紫外-可见检测器(选配) 1台 2 高压恒流泵 1台 3 色谱柱恒温箱(选配) 1台 4 Rheodyne 7725i高压六通进样阀 1个 5 阀支架 1个 6 W5100色谱数据工作站 1套 7 梯度混合器(选配) 1个 8 溶剂托盘 1台 9 C18 5Hm色谱柱 1支 10 荧光检测器 1台 11 AD适配器 1套 12 光化学衍生器 1套 13 自动进样器(选配) 1台 14 在线脱气机(选配) 1台 表3-2主要化学试剂、标准品清单 序号 试剂 纯度 1 乙腈 色谱纯 2 甲醇 色谱纯 3 氯化钠 分析纯 4 去离子水 18.2MQ 5 黄曲霉毒素B标准溶液 百灵威 表3-3主要样品前处理设备 序号 名称 规格型号 备注 溶剂过滤器 1000mL 流动相过滤 2 隔膜真空泵 0.08MPa，160W 流动相过滤， GM-0.33A 3 超声清洗器 3L/6L， 40/60KHz， 120W 流动相脱气， AS3120 4 高速万能粉碎机 转速大于10000r/min 5 试验筛 20目 6 精密电子天平 感量为万分之一 称量 7 高速均质器 转速大于10000r/min 8 免疫亲和柱 黄曲霉毒素B，免疫亲和柱 9 泵流操作架 含空气泵 实验过程中其它玻璃器皿还包括容量瓶(100mL、50mL、25mL、10mL、2mL)、具塞锥形瓶(250mL)，移液枪(0~1000uL，0~5000uL)、移液枪枪头(1mL， 5mL)、一次性PVC手套、一次性口罩、进样针、滤膜等若干。 3.3 实验方法 3.3.1 标准溶液配制 黄曲霉毒素Bi标准储备液(100ug/L)：黄曲霉毒素Bi样品(约5mL)置于 50mL容量瓶中，用甲醇定容。 黄曲霉毒素Bi标准工作液：用流动相稀释黄曲霉混标标准储备液分别配置的黄曲霉混标标准工作液。如其中B1浓度为 20.0ug/L， 10.0pg/L， 4.0ug/L， 2.0ug/L， 1.0ug/L， 0.5ug/L，0.2ug/L. 3.3.2样品前处理 3.3.3色谱条件 流动相：甲醇：乙腈：水=20：20：60(V：V：V) 色谱柱： SinoChrom ODS-BP5um4.6x200mm 流速：0.8mL/min 检测波长：激发360mm， 发射 450nm 进样量：20pL 柱温：：室温 3.4 实验结果 3.4.1 典型分离色谱图 进样分析浓度为20.0ug/L的黄曲霉毒素Bi标准工作液，使用3.3.3中的色谱条件，结果如下图所示。 60- 图3-3黄曲霉毒素Bi衍生色谱图 表3-4衍生结果对比 未衍生 衍生 峰面积(mV·sev) 峰高(mV) 峰面面(mV·sev) 峰高(mV) Bi 295.13 9.87 982.48 34.92 使用光化学衍生器后， B1峰面积和峰高增加约3.5倍。而对于噪声的影响，使用光化学衍生器前后，噪声基本保持不变，因此，Bi灵敏度能够分别提高约3.5倍。 3.4.2 线性与检出限 将黄曲霉毒素Bi标准工作溶液，按3.3.3中色谱条件进行光化学衍生后的分析，黄曲霉毒素Bi的线性及检出限如下表所示。 表3-5线性方程 物质 线性方程 线性相关系数R 黄曲霉毒素Bi y=62.4620x+0.6365 0.99992 从上表可知，黄曲霉毒素光化学系统衍生效果良好，Bi浓度在0.2ug/L到20.0pg/L线性范围内线性相关系数均大于0.999。 以3倍信噪比对应的浓度换算为仪器的检出限，，!以10倍信噪比对应的浓度为仪器的定量限。计算黄曲霉毒素Bi的检出限及定量限，结果如下表所示。 表3-6检出限对比 物质 方法检出限(ug/kg) GB/T5009.23-2006检出限(ug/kg) 黄曲霉毒素Bi 0.03 0.20 从以上结果可知，光化学系统衍生后的黄曲霉毒素检测的灵敏度明显低于国标中的要求， 完全符合定量要求。 3.4.3 实际样品 市场购买相关粮食，按本文中提到的方法并进行了分析，结果如下所示。 Retention time (min) 图3-4大米样品 表2-7大米样品 黄曲霉毒素 浓度(ug/L) 含量(ug/kg) B1 0.06 0.06 3.5 参考文献 [1]GBT 5009.23-2006《食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》 第2章脱氧雪腐镰刀菌烯醇的 HPLC 分析解决方案 4.1 前言 4.1.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇性质及危害 脱氧雪腐镰刀菌烯醇是粮食中最常见的一类污染性霉菌毒素，可对人、畜产生广泛的毒性效应，如食欲降低、体重减轻、代谢紊乱等。是最常见的一种污染粮食、饲料和食品的霉菌毒素之一，会严重影响人和牲畜的健康。近年研究发现，脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人和动物的免疫功能产生明显的影响。 4.1.2检测方法 结合 GB/T23503-2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱》，提出了粮食及粮食加工业中脱氧雪腐镰刀菌烯醇分析的全套解决方案。为粮食及粮食加工业中脱氧雪腐刀菌烯醇检测提供了包括从前处理设备、试剂、前处理方法直至到液相色谱方法的全套分析解决方案。相关人员可参考本实验中的方法，进行粮食及粮食加工业中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测。 4.2 仪器设备与试剂 表4-1高效液相色谱系统设备标准配置清单 序号 名称 数量 紫外-可见检测器 1台 2 高压恒流泵 1台 3 色谱柱恒温箱 1台 4 Rheodyne 7725i高压六通进样阀 1个 5 阀支架 1个 6 W5100色谱数据工作站 1套 7 梯度混合器(选配) 1个 8 溶剂托盘 1台 9 C18 5um色谱柱 1支 表4-2主要化学试剂、标准品清单 序号 试剂 纯度 1 乙腈 色谱纯 2 甲醇 色谱纯 3 氯化钠 分析纯 4 磷酸氢二钠 分析纯 5 磷酸二氢钾 分析纯 6 氯化钾 分析纯 7 盐酸 分析纯 8 去离子水 18.2MQ 9 聚乙二醇 相对分子量8000 10 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液 百灵威 表4-3主要样品前处理设备 序号 名称 规格型号 备注 溶剂过滤器 1000mL 流动相过滤 2 隔膜真空泵 0.08MPa，160W 流动相过滤， GM-0.33A 3 超声清洗器 3L/6L，40/60KHz， 120W 流动相脱气， AS3120 4 高速万能粉碎机 转速大于10000r/min 5 试验筛 孔径1mm 6 精密电子天平 感量为万分之一 称量 7 高速均质器 转速大于10000r/min 8 免疫亲和柱 脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱 9 泵流操作架 实验过程中其它玻璃器皿还包括容量瓶(100mL、50mL、25mL、10mL)、具塞锥形瓶(250mL)， 移液枪(0~1000pL，0~5000uL)、移液枪枪头(1mL，5mL)、.一次性PVC手套、次性口罩、进样针、定量滤纸，玻璃纤维滤纸、0.45um滤膜等若干。 4.3 实验方法 4.3.1 样品前处理 提取 粮食及粮食制品，首先将将样品研磨，硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛，不要磨成粉末。称取 25g(精确到0.01g)磨碎的试样于 100mL 容量瓶中，加入5g聚乙二醇，用水定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌 2min，首先以定量滤纸过滤， 然后再以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液于于净的容器中。 净化 将免疫亲和柱连接于10.0mL 玻璃注射器下，准确移取2.0mL 滤液于玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱。以5mLPBS 缓冲液和 5mL 水先后淋洗免疫亲和柱，流速约以1滴/s~2滴/s，直至空气进入亲和柱，弃去全部流出液，抽干小柱。 洗脱 准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中， HPLC测定。 PBS缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于990mL水中，用浓盐酸调节 pH 值至7.0，用水稀释至1L。 4.3.2色谱条件 流动相：甲醇：水=20：80(V：V) 色谱柱： C18色谱柱 5um4.6×150mm 流速：0.8mL/min 进样量：50pL 检测波长：218nm 柱温：35℃ 4.4 参考文献 [1]GB/T23503-2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱》。 第3章玉米赤酶烯酮 HPLC 分析解决方案 5.1 前言 5.1.1玉米赤酶烯酮性质 玉米赤霉烯酮(Zearalenone)又称F-2毒素，具有雌激素样作用，对肝脏肾脏均有强烈毒害作用，引起动物繁殖机能异常甚至死亡，也是影响食物安全的重要因素之一。本身具有分布广、繁殖快、耐热、代谢产物多、毒性大、残留时间长、难处理等问题。 5.1.2玉米赤酶烯酮结构 图5-1玉米赤酶烯酮 5.1.3对于粮食及粮食加工业的危害 玉米赤霉烯酮作为世界上污染粮食最广泛的真菌毒素之一，在谷物以及农副产品中都可检测到其的存在。玉米赤霉烯酮不仅可直接污染谷类等作物，进而进入人或动物体内，还可通过被污染的肉、奶等动物性食品进入人体，危害人和动物的健康。 5.1.4检测方法 结合 SN/T 1745-2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的检验方法》中的第一法和 GB /T 5009.209-2008《谷物中玉米赤霉烯酮的测定》，提出了粮食及粮食加工业中玉米赤霉烯酮分析的全套解决方案。为粮食及粮食加工业中玉米赤霉烯酮检测提供了包括从前处理设备、试剂、前处理方法直至到液相色谱方法的全套分析解决方案。相关人员可参考本实验中的方法，进行粮食及粮食加工业中玉米赤霉烯酮的检测。 5.2 仪器设备与试剂 表5-1高效液相色谱系统设备标准配置清单 序号 名称 数量 订货号 1 紫外-可见检测器(选配) 1台 31020023 2 高压恒流泵 1台 31010047 3 色谱柱恒温箱(选配) 1台 31040010 4 Rheodyne 7725i高压六通进样阀 1个 32027725i 5 阀支架 1个 18050004 6 W5100色谱数据工作站 1套 7 梯度混合器(选配) 1个 31060001 8 溶剂托盘 1台 9 C18 5um色谱柱 1支 31110107 10 荧光检测器 1台 11 AD适配器 1套 31030024 12 自动进样器(选配) 1台 31090005 13 在线脱气机(选配) 1台 31050006 表5-2主要化学试剂、标准品清单 序号 试剂 纯度 1 乙腈 色谱纯 2 甲醇 色谱纯 3 氯化钠 分析纯 4 磷酸氢二钠 分析纯 5 磷酸二氢钾 分析纯 6 氯化钾 分析纯 7 吐温-20(Tween-20) 分析纯 8 盐酸 分析纯 9 去离子水 18.2MQ 10 玉米赤酶烯酮标准溶液 Sigma-Aldrich 表5-3主要样品前处理设备 序号 名称 规格型号 备注 1 溶剂过滤器 1000mL 流动相过滤 2 隔膜真空泵 0.08MPa，160W 流动相过滤， GM-0.33A 3 超声清洗器 3L/6L，40/60KHz， 120W 流动相脱气， AS3120 4 高速万能粉碎机 转速大于10000r/min 5 试验筛 二号筛 7 8 免疫亲和柱 玉米赤酶烯酮免疫亲和柱 9 泵流操作架 含空气泵 实验过程中其它玻璃器皿还包括容量瓶(100mL、50mL、25mL、10mL)、具塞锥形瓶(250mL)，移液枪(0~1000pL，0~5000uL)、移液枪枪头(1mL， 5mL)、一次性PVC手套、次性口罩、进样针、槽纹折叠滤纸、玻璃纤维滤纸、0.22um滤膜等若干。 5.3 实验方法 5.3.1 标准溶液配制 玉米赤酶烯酮标准工作液：玉米赤酶烯酮标准工作液：分别配置浓度为 10pg/L、20ug/L、50ug/L、100ug/L、200ug/L、500ug/L 的玉米赤酶烯酮标准品工作液。 5.3.2样品前处理 提取 准确称取试样 40.0g(准确到 0.1g)(大豆需要磨细且粒度≤2mm)于均质器配置的搅拌钵中，加入4.0g氯化钠及100mL乙腈+水(9+1)，以均质器搅拌提取 1min。以槽纹折叠滤纸过滤，准确称取 10.0mL 滤液并加入40.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，滤液备用。 净化 将免疫亲和柱连接于 10.0mL 玻璃注射器下，准确移取10.0mL 样品提取液于玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以 6mL/min 流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL 空气通过免疫亲和柱。以10mL PSB/吐温-20缓冲液和 10.0mL水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2~3mL空气通过免疫亲和柱。准确加入1.5mL甲醇洗脱，流速为1~2mL/min。收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。 PBS/吐温-20缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于 900mL水中，用浓盐酸调节pH值至7.0，加入1mL吐温-20，用水稀释至1L。 流动相：乙腈：水：甲醇=46：46：8(V：V：V) 色谱柱： SinoPak SP5umID 4.6×150mm 流速： 0.8mL/min 进样量：10pL 检测波长：激发274nm， 发射 440nm 柱温：室温 按照5.3.3中的色谱条件，进乡分析浓度为200pg/L的玉米赤酶烯酮标准品工作液，结果如下所示。 10- 图5-2玉米赤酶烯酮标准溶液色谱图 表 5-4色谱峰参数 保留时间 峰高 峰面积 不对称度 柱效 (min) (mV) (mV·sec) (N/m) 玉米赤酶烯酮 9.27 5.18 73.70 1.14 11600 从以上结果可知，在该色谱系统中，玉米赤酶烯酮保留时间短，不对称度好，柱效高，适合于分析玉米赤酶烯酮。 5.4.2 线性范围与检出限 使用5.3.3中的色谱条件，依次连续进样分析浓度为10pg/L、20ug/L、50pg/L、100ug/L、200ug/L、500ug/L的玉米赤酶烯酮标准品工作液，结果如下所示。 表5-5线性相关性 线性方程 线性相关系数 浓度-峰面积曲线 y=0.33316x-0.55941 0.9999 从以上结果可知，玉米赤酶烯酮在浓度为 10~500ug/L范围内，线性相关系数均大于 0.999，浓度-峰面积具有良好的线性相关性。 以3信噪比作为检出限，10倍信噪比作为定量限，不断稀释并进样分析玉米赤酶烯酮标准品工作液，直至分别出现信噪比为3倍和10倍的浓度，结果如下所示。 图 5-3检出限及定量限 表5-6仪器及方法的检出限及定量限 仪器检出限 仪器定量限 方法检出限 方法定量限 (ug/L) (ug/L) (ug/kg) (ug/kg) 玉米赤酶烯酮 3 10 6 20 表5-7检出限对比及定量限 仪器检出限(ug/kg) 本方法 6 SN/T 1745-2006 10 GB/T5009.209-2008 5 5.4.3实际样品 市场购买豆油，按本文中的方法并进行了分析，结果如下所示。 图5-4豆油样品 表5-8豆油样品 浓度(ug/L) 含量(mg/kg) 玉米赤酶烯酮 未检出 未检出 5.5 参考文献 [1]SN/T 1745-2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的检验方法》。 ( [2]GB/T5009.209-2008《谷物中玉米赤霉烯酮的测定》。 ) 第4章赭曲霉毒素A 的 HPLC 分析检测解决方案 6.1 前言 6.1.1 赭曲霉毒素A性质及危害 赭曲霉毒素A是毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的一种霉菌毒素。赭曲霉毒素A 是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)、花生、蔬菜(豆类)等农作物上的曲霉和青霉产生的。产生赭曲霉毒素A的霉菌广泛分布于自然界，导致赭曲霉毒素A广泛分布于各种食品及粮食中。食用了含有赭曲霉毒素A的粮食及粮食加工的食物，在其内脏、组织及血液中含有大量的赭曲霉毒素A。赭曲霉毒素A主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。 6.1.2检测方法 结合 GB/T 25220-2010《粮油检验粮食中赭曲霉毒素A的测定高效液相色谱法和荧光光度法》，提出了粮食及粮食加工业中赭曲霉毒素A分析的全套解决方案。为粮食及粮食加工业中赭曲霉毒素A 检测提供了包括从前处理设备、试剂、前处理方法直至到液相色谱方法的全套分析解决方案。相关人员可参考本实验中的方法，进行粮食及粮食加工业中赭曲霉毒素A的检测。 6.2 仪器设备与试剂 表6-1高效液相色谱系统设备标准配置清单 序号 名称 数量 紫外-可见检测器(选配) 2 高压恒流泵 3 色谱柱恒温温(选配) 4 Rheodyne 7725i高压六通进样阀 5 阀支架 6 W5100色谱数据工作站 7 梯度混合器(选配) 8 溶剂托盘 9 C185um色谱柱 10 荧光检测器 11 AD适配器 12 自动进样器(选配) 表6-2主要化学试剂、标准品清单 序号 试剂 纯度 1 乙腈 色谱纯 2 冰醋酸 分析纯 3 氯化钠 分析纯 4 磷酸氢二钠 分析纯 5 磷酸二氢钾 分析纯 6 氯化钾 分析纯 7 吐温-20(Tween-20) 分析纯 8 盐酸 分析纯 9 碳酸氢钠 分析纯 10 去离子水 18.2MQ 11 赭曲霉毒素A标准溶液 百灵威 表6-3 主要样品前处理设备 序号 名称 规格型号 备注 溶剂过滤器 1000mL 流动相过滤 2 隔膜真空泵 0.08MPa，160W 流动相过滤， GM-0.33A 3 超声清洗器 3L/6L， 40/60KHz， 120W 流动相脱气， AS3120 4 高速万能粉碎机 转速大于10000r/min 5 精密电子天平 感量为万分之一 称量 6 高速均质器 转速大于22000r/min 7 免疫亲和柱 赭曲霉毒素A免疫亲和柱 8 泵流操作架 9 氮吹仪 实验过程中其它玻璃器皿还包括容量瓶(100mL、50mL、25mL、10mL、2mL)、具塞锥形瓶(250mL)，移液枪(0~1000pL，0~5000uL)、移液枪枪头(1mL，5mL)、一次性PVC手套、一次性口罩、进样样、槽纹折叠滤纸、玻璃纤维滤纸、0.22um滤膜等若干。 6.3 实验方法 6.3.1 标准溶液配制 提取 准确称取试样 50g(准确到0.001g)于均质器配置的搅拌钵中，加入5.0g氯化钠及100mL乙腈+水(6+4)，将搅拌杯装于均质器上，，于22000r/min 高速搅拌提取 3min。提取液以槽纹折叠滤纸过滤于干净的烧杯中。准确称取 10.0mL 滤液并加入 50.0mL容量瓶中，加PBS缓冲液稀释至刻度，混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤至澄清，滤液备用。 净化 将免疫亲和柱连接于10mL 玻璃注射器下端，准确移取 10.0mL 样品提取液于玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器上端连接，调节压力使溶液以1滴/s~2滴/s流速缓慢通过免疫亲和柱，至有空气通过免疫亲和柱时停止加压。用上述方法，，以10mL林洗缓冲液和10.0mL 水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，准确加入1.5mL甲醇以上述方式洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，在45℃以氮吹仪用氮气吹干。用流动相溶解残渣并定容至200uL， 即为试样提取净化液，供液相色谱测定时使用。 PBS缓冲液：称取 8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于990mL水中，用浓盐酸调节 pH值至7.0，用水稀释至1L。 淋洗缓冲液：称取25g氯化钠，5g碳酸氢钠溶于水中，加入 0.1mL 吐温-20，用水稀释至1L。 6.3.2色谱条件 流动相：：乙腈：水：冰醋酸=96：102：2(V：V：V) 色谱谱： C18色谱谱5um4.6×150mm 流速：：1.0mL/min 检测波长：激发333mm， 发射 460mm 进样量：20pL 柱温：室温 6.4 参考文献 [1]GB/T25220-2010 《粮油检验粮食中赭曲霉毒素A的测定高效液相色谱法和荧光光度法》。 黄曲霉毒素B1B2G1G2的HPLC分析解决方案前言l   什么是黄曲霉毒素黄曲霉毒素(Aflatoxins)是生长在食物及饲料中的黄曲霉和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有17种，主要是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2以及由B1和B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物M1、M2等。l   黄曲霉毒素性质黄曲霉毒素是一种毒性极强的物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中，以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。生产企业如果使用劣质的原料，如发霉的花生、菜籽、玉米等生产食用油，则有可能造成黄曲霉素超标。