Oxytocinn（OT,催产素或缩宫素）中定量分析检测方案(液质联用仪)

thermoscientific热线800 8105118电话4006505118www.thermofisher.com 基于二维液相色谱三重四极杆质谱建立Oxytocin快速灵敏的测定方法 徐媛，杨艳，张艳海，赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 摘要 Oxytocin (OT，催产素或缩宫素)是一种环状九肽类神经垂体激素，临床上主要用于催生引产、产后止血和刺激泌乳等功能。作为一种人血浆中含量极低的内源性激素(低至pg/mL)，对其检测方法的灵敏度要求很高。本文在Thermo ScientificTMVanquishTM Duo UHPLC液相系统串联三重四极杆质谱ThermoScientificTM TSQ QuantisTM平台建立了OT的快速灵敏的测定方法。该方法采用选择反应监控 (Selected Reaction Monitoring，SRM)扫描模式，经二维液相在线富集和净化，OT的检测限达1ppt，且在10ppt~1000ppt浓度范围具有良好的线性关系(r2=0.9994)，标曲点偏差小于11%。该方法简便、快速、灵敏，结合该设备和平台，可用于实际样品中OT的检测和定量。 OT是一种由9个氨基酸构成的内源性激素，主要作用于外周神经和中枢神经系统。在外周神经系统方面，OT主要起促进妇女分娩时的子宫收缩和哺乳时的乳汁分泌的作用。在中枢神经系统方面，OT起神经递质的作用，可调节母性行为、性行为和依恋行为。临床上主要用于催生引产、产后止血和刺激泌乳等。除此之外，OT能影响人与人之间社会关系的建立并调节情感行为，且与动物的社会行为如配偶选择、交配等有关[1-3]。血浆样本中OT的分析极具挑战性，本文建立了二维液相色谱串联质谱测定OT的方法。 二维液相色谱是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统，通过柱切换技术完成样品在二维色谱柱之间的流动。分析时，样品经过第一维色谱柱的分离，进入 切换阀的接口中，经捕集或切割后，被切换进入第二维色谱柱及检测器。与传统的液相色谱和离线固相萃取色谱分析相比，在线二维色谱的优势在于峰容量明显提升、复杂样品的基质效应和残留现象显著降低、以及自动化样品前处理以提高分析的通量。 本文将固相萃取技术和二维液相技术相结合，串联三重四极杆质谱，实现了对血浆等基质样本在线富集和净化，大大提高了OT的检测灵敏度。 2.1仪器与式剂 ( 2.1.1 Thermo ScientificTM VanquishTM Duo UH P LC， 柱温箱带一 个2位6通阀； ) Thermo ScientificTM TSQ QuantisTM三重四极杆质谱仪仪器连接图见图1。 ( 2.1.2SPE柱： SOLA HRP(10mg) ， 货号：60109-00 ， Thermo ScientificTM ) 2.1.3乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；实验用水为Milli-Q去离子水；甲酸(色谱纯， SIGMA)；乙酸铵(色谱纯， SIGMA) ( 12.1.4 Oxytocin标准品来自客户 ， 浓度为9300 ng/mL ) ( 2.2化合物信息及溶液配制 ) 2.2.1化合物信息(表1) Compound 化合物 CAS 分子式 分子量 Oxytocin 催产素 2.2.2储备液：9300 ng/mL 2.2.3标准溶液配制：以5：95乙腈水作为溶剂，稀释成系列标准曲线点： 1ppt， 2 ppt， 5 ppt， 10 ppt， 20 ppt， 50 ppt， 100 ppt，200 ppt， 500 ppt， 1000 ppt。 2.3色谱条件： 2.3.1一维液相条件 色谱柱： Thermo ScientificTM Hypersil GOLDTM ( 1.9 pm，50×2.1mm)； 流动相：A为水(0.1%FA&10mM乙酸铵)，B为乙腈，梯度洗脱程序(表2) 表2梯度洗脱程序 时间 A% B% 流速mL/min 0.00 85 15 0.2 0.80 85 15 0.2 5.0 50 50 0.2 5.01 20 80 0.2 6.0 20 80 0.2 6.01 85 15 0.2 8.5 85 15 0.2 2.3.2二维液相条件 色谱柱： Acclaim RSLC PolarAdvantage 2.1*50mm， 2.2 pm；流动相：A为水(0.1%FA&25%ACN)(表3) 柱温：35℃； 进样羊： 40pL； 流速： 0.5mL/min 表3等度洗脱程序 时间 A% B% 流速mL/min 0.00 100 0 0.5 8.5 100 0 0.5 2.4质谱条件： 可加热电喷雾电离源(HESI)，正离子扫描模式；扫描方式：SRM；喷雾电压(+)：4500V；离子传输俞温度：350℃；鞘气压力60 arb；辅助气压力20 arb；离子源温度：500℃；碰撞气压力：2mTorr；选择反应监测离子对信息见表4。 表4OT质谱采集参数 化合物 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量(V) 294.9 55 OT 1007.3 723.1* 30 图1 Vanquish 2D-LC-MS系统 2.5样品处理： SPE柱活化：1mL乙腈，随后111mL 1%磷酸溶液(磷酸：水=1：9， V/) 上样：吸取1.4 mL血浆到EP管中，然后向EP管中加入0.5 mL5%磷酸溶液(磷酸：水=5：95，V/V)，再加入适量的OT，一起上样到SPE柱中 冲洗：按顺序吸取以下溶液进行冲洗，1mL 1%磷酸溶液(磷酸：水=1：9，V/V)、1 mL 含0.1%TFA的乙腈：水溶液(乙腈：水=5：95，V/)、2 mL水 洗脱： 0.45mL含乙腈：水溶液(乙腈：水=60：40，V/V) 在室温条件下，将收集的洗脱液进行氮气吹干，然后用100 pL的乙腈：水溶液(乙腈：水=5：95， V/V)进行溶解，溶解液装液相小瓶，待上机分析。 3.1灵敏度测试 采用上述仪器分析方法，OT在8.5分钟内可获得良好的色谱峰，图2为OT在1 ppt的浓度下的提取离子流图。 图2OT的提取离子流图(1ppt) 3.2线性范围测试 采用上述仪器分析方法，对OT进行线性范围测试，线性相关系数R?为0.9994，线性关系良好。OT线性范围、线性相关系数、LOQ(S/N>10)、LOD结果见表5，化合物标准曲线图见图3. MS/MS检测5 ppt OT的谱图，进样量40 uL。对比两张谱图，可看出，富集后的色谱峰峰宽相比富集前的窄了一半，且S/N提高了10倍以上。由此可见，通过此二维液相系统的在线富集功能可有效提高目标物的信噪比，从而提高检出灵敏度。 0T Y=3.209e1X-3.685e1；R^2： 0.9994； Origin： Ignore； W： 1/X； Area 36000- 图3OT标准曲线图 Time (min 图5二维液相系统富集OT前后对比： A. 1D-LC-MS/MS； B.2D-LC-MS/MS 表5OT的线性范围、相关系数、LOQ、LOD 化合物线性范围相关系数线性方程 LOQ LOD (ppt) (r2) ) (ppt) (ppt) (ppt) OT 10~10000.9994 Y=3.209X-3.685 10 3.5 基质加标样考察 3.3稳定性测试 取空白人血浆基质，通过基质加标分别配制2 ppt、1 ppb两个加标样，按照上述2.5，进行样品前处理，检出结果如下(图6)。由图可看出，此二维液相系统串联三重四极杆检测人血浆中的OT，可有效降低基质影响，提高信噪比，检测灵敏度达2ppt 采用上述仪器分析方法，对OT进行稳定性测试，考察浓度10ppt，连续进样7针，实验结果见图4，相对标准偏差RSD%为14.8%，结果证明仪器稳定性良好。 图6基质样品检出色谱图(2ppt，1ppb) 图4 OT 10 ppt 重现性(n=7) 4.总结 3.4富集前后对比 图5对比了二维液相系统富集OT的前后差别，其中A图是1D-LC-MS/MS检测10 ppt OT的谱图，进样量20uL，B图是2D-LC- 本文建立了二维液相系统串联三重四极杆质谱(TSQ Quantis )分析OT的检测方法。由实验结果可以看出，基于此联用平台建立的检测方法不仅具有优异的灵敏度和线性范围，同时具备良好的重现性。本方法可用于OT的实际样品分析检测。 ( 5.参考文献 ) ( [1] Nachum z， Garmi G， Kadan Y， etal. Comparison bet-ween amniotomy， ox y tocin or both for augmentation of l abor inprolonged l a tenphase： a ra n domized cont r olled tria l [J]. Repro-ductive Biologyand Endocrinology， 2010， 8 (1)：136-143. ) ( [2] Gohil J T ， Tripathi B. A study to compare the efficacy ofmisoprostol， oxytocin， methl-ergometrine and e r gometrine-oxy-tocin in reducing blood l oss in active management of 3 rd stageof labor[J] . The Journal of Obstetrics and Gynecology o f India，2011， 61(4)：408-412. ) ( [3] Borg J， O hlsson B . Oxytocin prolongs the gastric e m -ptying t ime in patients with d i abletes mellitus and gastroparesis，but does not affect s a tiety or volume intake in pa t ients with func-tional dysperpsia[J ] . BMC Research Notes， 2012，5(1)：148-155. ) 本文建立了二维液相系统串联三重四极杆质谱（TSQ Quantis） 分析OT的检测方法。由实验结果可以看出，基于此联用平台建 立的检测方法不仅具有优异的灵敏度和线性范围，同时具备良 好的重现性。本方法可用于OT的实际样品分析检测。