谷物中黄曲霉毒素检测方案(超临界色谱)

使用超高效液相色谱和柱后光化学衍生法快速测定谷物中的黄曲霉毒素 肖尧，李功恒 在这篇应用简报中，我们参考国标 GB 5009.22-2016 的相关条件及规定，开发出一种基于超高效液相色谱(UHPLC)-柱后光化学衍生方法，用于快速分析食品中的四种黄曲霉毒素。对检测限(LOD)、定量限(LOQ)、重现性和回收率等方面进行了方法学考察，并对实际谷物样品进行了检测。 结果表明，，该方法在分离度和灵敏度等方面完全满足国标中相应的要求，且线性和重现性良好。更突出的是，与国标中推荐的分析条件相比，分析时间缩短一半且溶剂消耗量减少85%，极大地提升了分析效率并降低了分析成本。 黄曲霉毒素是一种由真菌产生的致癌物质。这种真菌在合适的温度和湿度条件下会在土壤、谷物、坚果或腐烂的植物中生长。自然界中自然产生的黄曲霉毒素至少有14种之多，其中毒性最大的是黄曲霉毒素B1。因此，许多国家和地区的监管机构都对食物中黄曲霉毒素B1的含量制定了严格的规定，并且通常同时对毒性比B1略小的其他三种黄曲霉毒素B2、G1 和G2的含量也做出相应规定。 现行国标 GB 5009.22-2016中规定了针对四种黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的检测方法及要求，其中涉及的检测方法有液质联用法、液相色谱法和酶联免疫法等。在诸多方法中，柱后光化学衍生法具有操作简便、设备使用维护成本低且无需使用腐蚀性试剂等优势，是分析实验室用于黄曲霉毒素分析的首选方法。但是国标推荐的高效液相色谱法所需的分析时间较长，溶剂消耗量较大。对于有高通量样品检测需求的实验室来说，迫切需要开发一种快速高效且低成本的分析方法，以提高实验室效率并降低运营成本。 在这篇应用简报中，我们参考 GB 5009.22-2016的相关要求，利用 Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统开发出一种灵敏、快速的超高效液相色谱 (UHPLC)-柱后光化学衍生方法，用于分析黄曲霉毒素 B1、B2、G1和G2。该方法在分离度和灵敏度等方面完全满足国标中相应的要求；线性和重现性良好；与国标方法相比，分析时间缩短一半且溶剂消耗量减少85%，在分析效率和分析成本方面具有显著优势。 试剂和样品 甲醇和乙腈为 HPLC级， 购于迪马公司；所用实验用水为通过美国 Millipore 公司 MilliQ 超纯水制备的超纯水。 黄曲霉毒素标准溶液 (B1、B2、G1、G2混标溶解于乙腈中，其中B1和G1的浓度分别为1.0 mg/L， B2 和 G2的浓度分别为0.3 mg/L) 购于上海安谱实验科技股份有限公司。 大米样品由安捷伦合作客户实验室提供并按照国标中相应的方法进行样品前处理。 仪器和设备 采用 Agilent 1290 Infinity lI 液相色谱系统，该系统配备如下安捷伦模块：二元泵(部件号G7120A)、多功能自动进样器(部件号 G7167B)、多功能柱温箱(部件号 G7116B)、荧光检测器(8uL流通池，部件号 G7121B)，并配备忠测 ZW-01型柱后光化学衍生器：((低流速配置，购于成都忠测科技有限公司)。 色谱柱选用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB C18 (2.1x100 mm，2.7 um， 部件号685775-902)。 标准品配制 依据国标GB 5009.22-2016中给出的标准曲线浓度系列配制标准系列溶液，具体步骤如下：取黄曲霉毒素标准溶液500uL置于5mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为工作液；然后分别准确移取工作液10、50、200、500、1000、2000、4000 uL 置于 10 mL 容量瓶中，前6个浓度点用初始流动相(水：甲醇：乙腈=68：16：16)定容至刻度，最高浓度点则用水定容至刻度；得到包含浓度分别为0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL 的黄曲霉毒素B1和G1以及浓度分别为0.03、0.15、0.6、1.5、3.0、6.0、12 ng/mL 的黄曲霉毒素 B2和 G2的系列标准溶液。 液相色谱条件 4种黄曲霉毒素的色谱分离结果 如图1所示，依照上述分析方法对标准曲线第4点浓度的混合标准品中的四种黄曲霉毒素进行分析。结果显示，四种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2得到良好的分离，分离度(Rs)均大于1.5，且空白进样中未发现对测定产生影响的干扰物质，表明该方法可用于对这四种黄曲霉毒素进行定量分析。 图1.4种黄曲霉毒素的液相色谱-柱后光化学衍生-荧光检测方法分离结果 标准曲线与相关系数 将7个浓度的系列标准溶液按浓度由低到高进样，每个浓度平行进样2次，以峰面积平均值为纵坐标、浓度为横坐标作图，进行线性回归分析。7个浓度点的叠加色谱图以及标准曲线回归分析结果如图2所示。从图中可以看出，黄曲霉毒素B1和G1 在 0.1-40.0 ng/mL 的浓度范围内且B2 和 G2在0.03-12ng/mL 的浓度范围内表现出良好的线性，相关系数R²均高于0.999。 EB2 B1 图2.上图：7个浓度点叠加色谱图；下图：4种黄曲霉毒素的线性回归方程和相关系数 将标准曲线第4点浓度(B1和G1：5.0ng/mL， B2 和 G2：1.5ng/mL) 对照品溶液分别进样8次，，以考察保留时间和峰面积重现性。结果列于表1中。各分析物的保留时间相对标准偏差 (RSD) 均小于0.07%， 且峰面积相对标准偏差均小于1.28%，表明该分析方法具有良好的重现性。 表1.4种黄曲霉毒素的保留时间及峰面积重现性 G2 G1 B2 B1 保留时间 RSD (%) 0.06 0.06 0.06 0.07 峰面积 RSD (%) 1.22 1.26 1.14 1.28 方法检测限 对国标 GB 5009.22-2016中规定的最低浓度的标准曲线溶液进行分析，并根据S/N=3计算检测限(LOD)， 根据 S/N= 10计算定量限(LOQ)，结果如表2所示。4种黄曲霉毒素的检测限和定量限完全满足国标中规定的液相色谱柱后光化学衍生法的要求(B1， G1 要求定量限0.1ug/kg， B2， G2 要求定量限0.03ug/Kg)。 此外，为确保低浓度样品检测的稳定性，还对标准曲线最低浓度点进行了重现性考察。将最低浓度的标准曲线溶液进样分析8次，计算峰面积的RSD。结果表明，四种黄曲霉毒素的峰面积 RSD 均小于4.8%(见表3)，完全可以保证在 LOQ 附近的检测重现性。 表2.4种黄曲霉毒素的检测限及定量限 G2 G1 B2 B1 LOQ (ppb) 0.02 0.09 0.009 0.03 LOD (ppb) 0.007 0.03 0.003 0.009 表3.4种黄曲霉毒素在标准曲线最低浓度点的峰面积 RSD 值(8次进样) G2 G1 B2 B1 峰面积 RSD (%) 4.80 2.79 3.27 2.14 样品分析结果 方法调整和优化 采用上述方法对实际大米样品进行分析。大米样品依据国标中的前处理方法进行处理后进样，所得结果见图3。从图中可以看出，黄曲霉毒素的分析不受样品基质的干扰。阳性检出样品中的黄曲霉毒素可以得到灵敏地检测和定量，计算出其中B1和B2的含量分别为 0.32 ppb 和0.033 ppb. 经过方法调整和优化，本文所述的 UHPLC 方法在分析速度和溶剂消耗量方面显著优于国标推荐的 HPLC 方法。单个样品所需的分析时间从18分钟缩短至8分钟以内，比较结果见图4.按照流速和分析时间折算，单个样品所需的溶剂消耗量减少了85% 图3.上图：阴性检出大米样品(绿色：样品；蓝色：标样)；下图：阳性检出大米样品(绿色：样品；蓝色：标样) 图4.上图： HPLC方法色谱图；下图： UHPLC 方法色谱图 由于乙腈对于光化学衍生反应具有一定的抑制作用，因此我们尝试进一步优化方法：去除流动相中的乙腈，将方法流动相调整为水：甲醇=65：35。分别在流动相中包含乙腈和不含乙腈的条件下((其他色谱条件不变)进样分析相同浓度的样品，所得结果如图5所示。从图中可以看出，各个峰的保留时间基本不变，而不含乙腈的条件使黄曲霉毒素G1 和B1的峰高分别增加了23%和32%，表明对这两种黄曲霉毒素的灵敏度得到改善。另外，调整流动相后， G1 和B2的分离度也有所提高，可以达到2.5。但是去除乙腈后，方法选择性发生改变，因此在检测不同基质时，可能需要根据样品实际情况调整甲醇的比例以确保干扰物获得完全分离。 图5.上图：流动相含乙腈；下图：流动相不含乙腈 本应用简报介绍了一种同时测定食品基质中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的基于超高效液相色谱-柱后光衍生-荧光检测法。该方法具有良好的线性和重现性，且检测限和定量限完全满足现行国标方法的要求。对实际样品的检测结果表明，该方法能够很好地分离目标分析物与基质峰。同时与国标中推荐的HPLC 方法相比，该方法具有分析速度快、溶剂消耗量少等突出优势，有望满足高通量实验室的快速高效的分析方法的需求。该方法中使用 Agilent Poroshell系列表面多孔色谱柱，这类色谱柱的柱效高、反压低，且具有优异的抗污染堵塞能力，尤其适合用于复杂食品样品的高通量分析。 ( 1.GB 5009.22-2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定 ) www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更， 恕 不另行通知。 ) ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2021 本应用介绍了一种同时测定食品基质中黄曲霉毒素  B1、B2、G1 和 G2 的基于超高效液相色谱-柱后光衍生-荧光检测法。该方法具有良好的线性和重现性，且检测限和定量限完全满足现行国标方法的要求。对实际样品的检测结果表明，该方法能够很好地分离目标分析物与基质峰。同时与国标中推荐的HPLC 方法相比，该方法具有分析速度快、溶剂消耗量少等突出优势，有望满足高通量实验室的快速高效的分析方法的需求。该方法中使用 Agilent Poroshell 系列表面多孔色谱柱，这类色谱柱的柱效高、反压低，且具有优异的抗污染堵塞能力，尤其适合用于复杂食品样品的高通量分析。