玉米粉中提取物检测方案(液相色谱仪)

自动在线样品制备结合LC-MS/MS分析玉米粉提取物中真菌毒素 Yang Shi，Catherine Lafontaine， Francois EspourteilleThermo Fisher Scientific， Franklin， MA 引言 自1960年发现黄曲霉毒素以来，真菌毒素的研究已经获得了相当的重视。真菌毒素是一种由某些霉菌产生的天然的毒性物质，这些霉菌可能污染食品和饲料。真菌毒素被身体吸入可能导致伤害，包括肝肾损害、癌症甚至导致人畜死亡。从食品安全的角度来看，黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、棒曲霉素、伏马毒素、单端孢和玉米赤霉烯酮是人们主要关注的真菌毒素。 如今许多国家监测食品和饲料产品中的真菌毒素水平。液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)目前是定量分析真菌毒素的最常见方法。?LC-MS/MS分析的样品制备可能耗时费力，通常需要调节PH值，固定相或者免疫亲和柱的净化萃取，多步骤萃取净化和预富集。3欧盟于1999年发布的严格法规要求更低的检测限和更高的方法可靠性，因此提出了新的分析挑战。 在本研究中，我们采用具有Thermo Scientific TurboFlow技术的Thermo Scientific Transcend TLX-1系统，说明了一个简单综合的LC-MS/MS方法，以分析玉米粉提取物中多种真菌毒素。图1展示了一款典型的Transcend TLX-1系统以及ThermoScientific TSQ Vantage三重四极杆质谱仪。 目标 开发一种快速灵敏的自动在线样品制备LC-MS/MS方法，以检测和定量玉米粉提取物中多种真菌毒素，实现更短的分析时间和更高实验通量。 实验 基质标准曲线 从本地杂货铺购买的玉米粉5 g， 采用25mL的70%甲醇水溶液萃取，然后超声处理60min。萃取液在室温下过夜，然后以6000RPM离心处理20 min。上层清液用于制备基质校正液和QC样品。每毫升上清液对应着0.2g固体玉米粉。 图1 Thermo Scientific Transcend TLX系统以及TSQ Vantage三重四极杆质谱仪 待测物的储备混合溶液在甲醇中制备。表1列出所选的反应监测(SRM)离子对和每个待测物的储备浓度。在正离子电喷雾电离(ESI)模式下分析八种真菌毒素。其他三个化合物，呕吐毒素(DON)、瓜萎镰菌醇(NIV)、3-乙酰基-D0N(3-AcDON)都在负离子电喷雾电离(ESI)模式下进行分析。 表1待测物列表 母离子-.一级 二级 储备浓度 化合物 (m/z) (m/z) (m/z) (pg/mL) Aflatoxins B1 313 241 285 0.050 Aflatoxins B2 315 259 287 0.015 Aflatoxins G1 329 243 283 0.050 Aflatoxins G2 331 245 275 0.015 Zearalenone (ZEA) 319 187 185 10.000 Ochratoxin A (OTA) 404 239 221 1.000 Fumonisins B1 (FB1) 722 334 352 2.500 Fumonisins B2 (FB2) 706 336 318 2.500 Deoxynivalenol (DON) 295 138 265 20.000 Nivalenol (NIV) 311 281 205 20.000 3-Acetyl-D0N (3-AcDON) 337 307 173 20.000 采用正离子ESI模式的LC/MS方法(方法A)： TurboFlowTM方法参数 色谱柱： TurboFlow Cyclone-P 0.5x50 mm 进样体积： 10 p.L 溶剂A： 10 mM 醋酸铵水溶液 溶剂B： 0.1%甲酸的乙腈溶液(ACN) 溶剂C： 1：1：1ACN：异丙醇：丙酮(v：v：v)，以及0.3%甲酸 HPLC方法参数 分析柱： Thermo Scientific Hypersil GOLD 2.1 x100 mm， 1.9 pum溶剂A： 0.1%甲酸的水溶液 溶剂B： 0.1%甲酸的ACN溶液 质谱仪参数 质谱仪： TSQ VantageTM 三重四极杆质谱仪 质谱离子源： 加热电喷雾电离(H-ESI)喷雾电压： 5KV鞘气压力(N，)：50 arbitrary units 辅助气体压力(N，)： 20 arbitrary units 气化室温度： 209°C 毛细管温度： 270°C 采用负离子ESI模式的LC/MS方法(方法B)： TurboFlow方法参数 色谱柱： Research柱A0.5x50mm 进样体积： 10 pL 溶剂A： 水 溶剂B： 甲醇 溶剂C： 0.1%的氢氧化胺 溶剂C： 45：45：10 ACN：异丙醇：丙酮(v：v：v) HPLC方法参数 分析柱： Thermo Scientific Hypersil GOLD 2.1x50 mm，1.9 p.m溶剂A： 0.1%甲酸的水溶液溶剂B： 0.1%甲酸的ACN溶液 质谱仪参数 质谱仪： TSQ VantageTM三重四极杆质谱仪 质谱离子源： 加热电喷雾电离(H-ESI) 喷雾电压： 4.5KV 鞘气压力(N，)：550 arbitrary units 辅助气体压力(N，)： 20 arbitrary units 气化室温度： 250°C 毛细管温度： 270°C 碰撞气体压力：1.5 mTorr Thermo Scientific Aria操作软件的LC方法视图显示在图2和图3中。 Step Start Sec Flow Grad %C %D Tee Loop Flow Grad %A %B 1 0.00 45 2.00 Step 100.0 - out 0.30 Step 98.0 2.0 2 0.75 5 0.10 Step 100.0 - - out 0.30 Step 98.0 2.0 3 0.83 120 0.10 Step 100.0 - - - T in 0.30 Step 98.0 2.0 4 2.83 5 2.00 StepP 100.0 - out 0.30 98.0 2.0 56 2.92 90 2.00 Step -： - 100.0 Step out 0.30 Ramp 60.0 40.0 7 4.428.08 220220 2.002.00 StepStep - 100.0- 100.0 - outout 0.300.30 Ramp 30.02.0 70.098.0 8 11.75 45 2.00 Step - 100.0 - in 0.30 Ramp Step 2.02.0 98.0 9 12.50 180 2.00 Step 100.0 out 0.30 Step 98.0 2.0 图2： Aria OS软件的方法A视图 Step Start 5ec %C %D Tee Loop Flow Grad %A %B 00：00 45 1.50 Step 100.0 out 0.30 Step 98.0 2.0 2 00：45 60 0.07 Step 100.0 - - in5n 0.50 Step 98.0 2.0 3 01：45 45 1.50 5tep 100.0 - out 0.30 Ramp 20.0 B0.0 4 02：30 45 1.50 5tep - 100.0 5 03：15 45 1.50 Step 50.0 50.0 out 0.30 RampRamp 10.0 90.0 out 0.30 2.0 98.0 6 04：00 30 1.50 5tep - - 100.0 out 0.30 Step 2.0 98.0 7 04：3004：45 1530 1.50 Step 100.0 out 0.30 5tep 2.0 98.0 89 05：15 150 1.50 1.50 Step Step 100.0 5.0 - 95.0 - - in 0.30 Step 98.0 2.0 out 0.30 Step 98.0 2.0 图3： Aria OS软件的方法B视图 结果和讨论 图4显示在甲醇和玉米粉萃取液(1：100稀释)中，8个待测物的色谱图比较，表明在标准溶剂和基质内良好色谱分离。基质匹配的校正溶液对其中六个化合物(表2)显示2个数量级的线性响应(r²>0.99)。由于基质诱导电离的变化，FB1和FB2的信号明显增强，这种变化之前有过多位研究者报道。5在将来的工作中，同位素标记的内标可能用于补偿基质干扰。 由于DON、NIV和3-AcDON在负离子电离模式下具有更好的响应，因此为它们开发了一个单独的LC-MS/MS方法。图5显示在玉米粉萃取液中100 ng/mL的DON、NIV和3-AcDON的色谱图。 图6代表DON和NIV的线性拟合校正曲线，显示了动态范围内出色的线性拟合。表3总结了负离子模式下三种待测物的检测、定量限和标准曲线线性。对于所有待测物，使用目前方法获得的定量限符合欧盟定义的食品最高水平。6据我们所知，这是采用自动在线样品制备技术联合串联质谱检测这三种化合物的第一篇应用文献。 另外，由于TurboFlow色谱柱可以应付更大的进样量(几百微升)，因此可以实现更低的定量限(LOQ)，而常规的HPLC或者UHPLC却无法实现这一功能。 图4在甲醇和玉米粉萃取液(1：100稀释储备溶液)中，8个待测物的SRM色谱图比较 图5在玉米粉萃取液中100 ng/mL的DON、NIV和3-AcDON的色谱图 表2正离子模式下待测物的定量限(LOQ)和标准曲线线性(r²) 表3负离子模式下待测物的LOQ和标准曲线线性 (ng/g) B1 0.50 0.9956 G1 0.50 0.9910 OTA 5.00 0.9937 ZEA 50.00 0.9955 FB1 12.50 0.9984 FB2 12.50 0.9965 Deoxynivalenol (DON) r2 25.00 0.9934 25.00 0.9933 Deoxynivalenol Nivalenol Figure 6. Calibration curves for DON and NIV 结论 开发一种快速灵敏的定量方法总是真菌毒素分析的一个主要目标。本文开发两种快速的自动在线样品制备LC-MS/MS方法，对于分析玉米粉萃取物中的真菌毒素具有足够的灵敏度。通过消除人工样品制备，这种方法的可靠性得以显著提高。采用Transcend TLX-2 (或TLX-4)系统在不同LC通道上进行这两种方法可以提高样品通量。未来的工作将更关注这种方法在不同食品基质和参比物上的应用。 上海北京广州服务热线上海浦东北京东城区安定门东大街28号广州市东风中路410-412号8008105118新金桥路27号6号楼雍和大厦西楼F座7层时代地产中心3001-04室400650 5118邮编：201206邮编：100007邮编：510030电话：021-68654588电话：010-84193588电话：020-83145188analyze.cn@thermofisher.com传真：021-64457830传真：010-66210845传真：020-83145288www.thermo.com.cn inermOSCIENTIFIC ThermoSCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific