食品玉米粉中黄曲霉素 B1, B2, G1 和 G2检测方案(液相色谱仪)

作者 伊利诺伊理工学院 伊利诺伊州 美国 Peter JW Stone 安捷伦科技 史蒂文斯河大道 美国加州圣克拉拉市，95051 美国 三重串联四极杆液质联用仪用于食品中黄曲霉素B，， B，，G，和G，的高灵敏度 检测 应用摘要 食品安全 摘要 采用简单而且低成本的分散固相萃取法(C18) 进行样品前处理能有效地去除基质背景，使得三重四极杆液质对于黄曲霉毒素的检测限达到 fg 水平。本方法具有分离度高，分离速度快(<6min)的优点。在 0.1-100 pg/L浓度范围内，每种黄曲霉毒素都具有很好的线性相关性(>0.998)。使用分散固相萃取作为样品净化方法，食品基质中添加的四种黄曲霉毒素标准品回收率在85-110%之间，和其他广泛应用的常规 SPE 方法相当。对于本文中的四种食品基质，其检测限<0.15 pg/kg， 定量限<0.5 pg/kg。分结结果的变异小于5%(相对标准偏差， RSD)。 黄曲霉素是由真菌寄生曲霉和黄曲霉产生的代谢物，是真菌毒素的一种[1]。它们可能出现在谷物、坚果和香料等食品中[2]。主要存在四种天然的黄曲霉素： B.，B，，G，和G，(图1)。接触黄曲霉素可能会引起人类和牲畜的癌症，因此需要可靠而且高灵敏度的检测方法以保证食品的安全。 实验条件 本方法使用的液质联用系统是使用喷射流离子聚焦技术的安捷伦6460三重串四极杆液质联用仪[3]和安捷伦1200 SL系列液相色谱，液相系统包括二元高压泵 (G1312B)，真空脱气机 (G1379B)，超低残留自动液体进样器(G1367D)，柱温箱(G1316B) 和MassHunter 数据分析系统 黄曲霉素标准品和待测食品 高纯度黄曲霉毒素(B，B ，G，和G，)购自 Sigma-Aldrich。不含黄曲霉毒素的玉米粉，花生和核桃仁购自当地的杂货店。 图1.黄曲霉素BBzG，和Gz的结构 质谱离子源条件和配置： 使用喷射流离子聚集技术的安捷伦6460三重串联四极杆液质联用仪。 离子源参数： 离子化模式： 喷射流离子聚焦电喷雾，正模式 毛细管电压： 4000V 干燥气(氮气)： 10 L/min 干燥器温度： 325°C 雾化气(氮气)： 50 psi 鞘气温度： 350°C 鞘气流速： 11L/min 喷嘴电压： 0 V Q1和Q2分辨率： 0.7 amu [自动调谐模式] Delta EMV： 400V 三重串联四极杆液质多反应监测模式(MRM) 参数见表1。安捷伦自动参数优化软件(MassHunter Optimizer) 可以自动得到每个待测组分的最佳碰撞电压，二级质谱碰撞能量，并确定最优的子离子。 表1.黄曲霉素和对应内内的 MRM参数 名称 (min) (V) (m/z) (m/z) (eV) 黄曲霉素B， 4.68 130 313.1 241.1 285.1 269.1 黄曲霉素 B， 4.57 130 315.1 287.1 259.1 243.1 黄曲霉素 G， 4.40 130 329.1 243.1 311.1 283.1 黄曲霉素G， 4.26 130 331.1 245.1 285.1 313.1 内标同位素B， 4.68 130 330.1 301.1 255.1 内标同位素B， 4.57 130 332.1 303 273.0 内标同位素G， 4.40 130 346.1 257.1 299.1 内标同位素 G， 4.26 130 348.1 330.1 259.1 样品前处理和回收率研究 样品溶液 14000 rpm 离心3分钟，然后准备进样分析。 玉米粉，面粉，花生和核桃仁(每个样品10克)，然后添加四种黄曲霉素标准品，浓度分别为5和25 ng/g。在室温条件下样品用40毫升甲醇-水(84：16， v/v)震荡提取 30分钟。提取液用 C18粉末吸附剂 (ODS固相萃取吸附剂，安捷伦部件号5982-1182)和MycoSep 226 多功能固相萃取吸附剂 (Romer) 进行净化。 ( 每一种食品基质和加标浓度都重复7次，以便于统计学分析。样品前处理的整个过程见图2. ) 取0.4毫升上清液加0.6毫升10mM醋酸铵水溶液。 图2.样品制备流程示意图，分散固相萃取净化与目前广泛使用的固相萃取净化方法 结果与讨论 实验部份描述的快速色谱方法使得黄曲霉素混合物得到了很好的分离，而且分析时间小于6分钟。典型的离子流图见图3(a)—-浓度为1 ppb的各黄曲霉素和见图3(b)——浓度为2.5ppb的对应同位素标记的黄曲霉素内标的离子流图。离子流图是多反应检测模式下的提取离子的叠加图 (EICs)。 在0.1到 100 ppb 的浓度范围内，黄曲霉素 B1， B2， G1 和G2都具有很好的线性，线性相关性 (R2)优于0.999.图4是在同一个水平上四个黄曲霉素校准曲线的叠加图，没有进行内标修正。使用内标可以有效地校正基质效应，结果见图5. G2 响应 vs 采集时间(min) 图3.浓度1 ppb 的黄曲霉素B，B，G，和G，和浓度为 2.5 ppb 的同位素标记的黄曲霉素的 LC/MS/MS色谱图 50 110 图4.黄曲霉素B，BG，和G，校正曲线的叠加图 为了测定检测限(LOD) 和报告限(LOR)，对于每一种食品基质，用前面介绍的两种样品净净流程和LC/MS/MS方法重复7次。本文中的分析结果是7次分析结果的平均值(N=7)。 检测限是在峰对峰信噪比大于等于3的条件下测得的。报告限是在峰对峰信噪比大于等于10的条件下测得的。 表2是四种食品基质中每一种黄曲霉素的检测限 (LOD)和报告限(LOR)。对四种样品基质和两种净化流程，黄曲霉素的检测限小于0.15 pg/kg，定量限小于0.5 pg/kg. 表3和4总结了7次重复实验分析的检测限数据。表3是用分散固相萃取净化得到的数据，表4是用Mycosep 净化得到的数据。 表2.是四种食品基质及两种净化方法得到的黄曲霉素的检测限(LOD) 和报告限(LOR) 黄曲霉素 (#226， Romer) 安捷伦部件号5982-1182 B. LOD LOR LOD LOR 食品基质 ng/g(S/N>3) ng/g(S/N>10) ng/g(S/N>3) ng/g(S/N>10) 玉米粉 0.047 0.16 0.060 0.20 (7次重复平均值) 0.036 0.12 0.085 0.28 0.08 0.28 0.10 0.35 0.046 0.15 0.033 0.11 面粉 0.068 0.23 0.012 0.042 (7次重复平均值) 0.11 0.36 0.037 0.12 0.14 0.47 0.15 0.50 0.038 0.13 0.11 0.36 花生 0.051 0.17 0.056 0.19 (7次重复平均值) 0.045 0.15 0.069 0.23 0.07 0.23 0.05 0.15 0.052 0.17 0.14 0.45 核桃仁 0.12 0.41 0.093 0.31 (7次重复平均值) 0.035 0.12 0.098 0.33 0.03 0.10 0.12 0.40 0.047 0.16 0.04 0.13 表3.利用分散固相萃取净化方法得到黄曲霉素B，B，G，和G，的检测限(LOD) 表4.利用 Mycosep， #226净化方法得到的黄曲霉素B，BzG，和G，的检测限(LOD) 食品基基在分散固相萃取净化和 Mycosep 固相萃取净化条件下，黄曲霉素回收率的对比。正如结果所示，两种样品净化方法的回收率都在85-110%之间， MycoSep 净化法仅在核桃仁样品稍微优于分散固相萃取法。 图6(a).使用Cg分散固相萃取法得到的黄曲霉素B，BG，和G，的回收率 b)MycoSep 净化法 图6(b). 使用Mycosep #226 净化法得到的黄曲霉素B，B，G，和G，的回收率 表5至8是对于每一种食品基质中黄曲霉素的回收率数据，添加浓度分别为 5 ng/g 和25 ng/g。每一种样品分为两份，分别用 C18 分散固相萃取和 Mycosep #226法进行净化，详细的流程见图2(a)。 表 6.加标的面样品- -回收率数据(百分回收率，±RSD，N=7) 加标5 ng/g的 玉米粉样品， C18 加标5ng/g的 加标25 ng/g的 加标5ng/g的 加标25 ng/g 的 玉米粉样品， C18 玉米粉样品， C18 玉米粉样品， 玉米粉样品， 黄曲霉素 分散固相萃取净化 分散固相萃取净化 Mycosep #226 净化 Mycosep #226 净化 无内标 B 100.1±4.4 96.6±2.9 113.5±5.9 100.6±1.8 B 98.2±6.9 96.4±2.6 105.1±4.5 102.1±4.4 G 100.5±5.5 105.4±3.8 111.5±10.4 106.1±4.0 内标 G， 104.9±3.2 106.7±1.3 108.6±5.2 103.7±2.9 内标 B 100.9±3.6 109.3±4.7 107.5±4.8 111.7±4.9 B， 85.2±7.7 99.8±2.8 92.4±6.3 101.0±4.0 G 110.6±7.8 112.8±1.8 117.6±7.7 109.3±5.7 G， 108.4±6.2 108.3±3.9 115.6±7.1 109.8±3.6 表7.加标的花生样品-——回收率数据(百分回收率，±RSD，N=7) 加标25ng/g 的 加标5 ng/g的 加标25ng/g 的 玉米粉样品， C18 玉米粉样品， 玉米粉样品， 分散固相萃取净化 Mycosep #226 净化 Mycosep#226净化 97.0±4.6 112.0±8.4 104.9±1.7 108.0±4.6 104.5±2.0 加标5 ng/g的 玉米粉样品， C18 黄曲霉素 分散固相萃取净化 无内标 B 96.7±3.4 B2 98.3±4.7 G 95.0±5.6 G 100.0±2.3 内标 B 101.8±3.6 B 102.5±5.5 G 105.7±7.3 G 107.5±10.9 加标5 ng/g的 97.4±2.9 95.0±4.9 109.9±2.1 105.7±3.4 100.0±2.0 114.7±3.2 106.3±1.1 96.1±2.0 100.0±6.8 103.0±3.5 100.2±5.0 99.4±4.1 102.9±2.7 99.2±2.2 105.2±4.3 101.7±5.2 104.9±6.7 109.3±8.7 102.4±3.1 表8.加标的核桃仁样品——回收率数据(百分回收分，±RSD，N=7) 玉米粉样品， C18 玉米粉样品， C18 玉米粉样品， 玉米粉样品， 黄曲霉素 分散固相萃取净化 分散固相萃取净化 Mycosep#226净化 Mycosep #226 净化 无内标 B 84.9±3.7 85.2±2.2 101.4±3.2 101.0±2.3 B， 91.5±3.9 89.8±2.8 104.2±7.9 106.3±2.9 G 89.4±4.4 86.7±1.5 103.9±5.9 101.7±4.2 G， 84.0±4.0 83.1±1.3 109.9±3.4 106.3±1.5 内标 B 106.5±4.9 98.9±4.1 93.8±1.4 100.2±2.9 B， 99±5.4 96.5±3.5 92.4±2.7 98.7±4.4 103.2±5.9 94.9±2.5 102.8±9.0 102.1±3.9 100.2±6.2 97.5±4.6 99.5±6.8 101.2±3.8 结论 本文开发了一种样品净化成本相对较低的LC/MS/MS方法用于坚果中黄曲霉素B，B，，G，和G，的分析，其检测限低于1 ppb。本方法利用分散 C18固相萃取技术进行样品的净化(安捷伦部件号5982-1182)。这种样品净化方法与当今广泛使用的前处理方法的黄曲霉素的回收率相当。 黄曲霉素检测限小于 0.15 pg/kg， 报告限小于 0.5 pg/kg (玉米粉，面粉，花生和核桃仁)。 黄曲霉素B，B，G，和G，在0.1-100ppb 的浓度范围内具有优异的线性，相关系数(R2)大于0.999. 利用C18分散固相萃取法进行样品净化，黄曲霉素的回收率在85-110%之间。 ( 参考文献 ) ( 1. Microhim Acts 153， 2006，101-108 ) ( 2. Rapid Commun. Mass Spectrum， 2009；23： 3 -11 ) ( 3. " Agilent Jet Stream Thermal Gradient Focussing Technology"安捷伦出版号5990-3494EN ) 更多信息 有关安捷伦产品和服务的更多信息，请访问我们的网站www.agilent.com/chem/cn。 有关本应用的更多信息，请联络 Peter JW Stone，安捷伦科技有限公司， 5301 Stevens Creek Blvd， Santa Clara， CA， 95051， USA. 本文提到的商品名称、商标，制造商所涉及的任何具体商业化产品或非盈利性组织、流程或服务等，并不代表其受美国政府的认可、推荐或支持。作者的观点和意见，并不代表美国政府的立场，不得用于广告或产品宣传目的。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本文可能存在的错误或由于提供、展示或使用本文所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2010 ( 中国印刷 ) 2010年12月2号 5990-6894CHCN Agilent Technologies 摘要采用简单而且低成本的分散固相萃取法（C18）进行样品前处理能有效地去除基质背景，使得三重四极杆液质对于黄曲霉毒素的检测限达到fg 水平。本方法具有分离度高，分离速度快(< 6 min)的优点。在0.1–100 μg/L 浓度范围内，每种黄曲霉毒素都具有很好的线性相关性(> 0.998) 。使用分散固相萃取作为样品净化方法，食品基质中添加的四种黄曲霉毒素标准品回收率在85–110%之间，和其他广泛应用的常规SPE 方法相当。对于本文中的四种食品基质，其检测限< 0.15 μg/kg，定量限< 0.5 μg/kg。分析结果的变异小于5%（相对标准偏差，RSD）。前言黄曲霉素是由真菌寄生曲霉和黄曲霉产生的代谢物，是真菌毒素的一种。它们可能出现在谷物、坚果和香料等食品中。主要存在四种天然的黄曲霉素：B1, B2, G1 和G2 。接触黄曲霉素可能会引起人类和牲畜的癌症，因此需要可靠而且高灵敏度的检测方法以保证食品的安全。结论本文开发了一种样品净化成本相对较低的LC/MS/MS 方法用于坚果中黄曲霉素B1, B2, G1 和G2的分析，其检测限低于1 ppb。本方法利用分散C18 固相萃取技术进行样品的净化(安捷伦部件号5982-1182) 。这种样品净化方法与当今广泛使用的前处理方法的黄曲霉素的回收率相当。黄曲霉素检测限小于0.15 μg/kg，报告限小于0.5 μg/kg（玉米粉，面粉，花生和核桃仁）。黄曲霉素B1, B2, G1和G2在0.1 - 100 ppb 的浓度范围内具有优异的线性，相关系数（R2）大于0.999。利用C18 分散固相萃取法进行样品净化，黄曲霉素的回收率在 85-110%之间。扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”微信公众号，获取更多解决方案资讯。