红茶和橙子中244 种农药残留检测方案(液质联用仪)

表 1.LC/MS 参数 应用简报 Agilent食品检测与农业Trusted Answers 使用 Agilent 6470B 三重四极杆 LC/MS系统对红茶和橙子基质进行多残留农药分析 Kyle Covert 和 Linfeng Wu 安捷伦科技有限公司 本应用简报介绍了一种利用 Agilent 6470B 三重四极杆 LC/MS 系统检测食品基质中244种农药残留的 LC/MS/MS 筛查方法。有机橙子和红茶由于所含成分复杂，因此被选择用于评估该方法检测食品基质中农药残留的性能。在橙子基质中，除一种目标农药外，其余所有目标农药均可在小于或等于欧盟委员会规定的默认最大残留限量(MRL) 10 pg/kg 的水平被检出。在浓红茶基质中，239种农药可在小于或等于10 ug/kg 的浓度被检出。研究人员还研究了基质效应对分析物响应的影响，结果表明，橙子基质和红茶基质中分别有50%和40%的农药可在 SANTE 指导原则要求的范围内(80%-120%)得到回收。这些结果证明，6470B三重四极杆 LC/MS 可满足高灵敏度要求，能够对食品基质中的农药进行准确、精密地定量分析。 前言 农药对于保护农作物起着不可或缺的作用，在大多数农产品的生长环境中，为实现高产量，往往需要使用农药。因此，我们十分关心所购买的农产品中是否存在农药及其含量。在如今各类有机产品和无机产品琳琅满目的市场上，这一点尤其值得关注，因为食品真伪或食品污染会影响有机食品的质量。监管机构(例如，美国环保局(US-EPA)[1.3]和欧盟委员会)制定了相应的法规来限制农药的使用以及允许量，从而保证消费者购买到安全的食品。最大残留限量(MRL)是指正确使用农药时(良好的农业生产方式)，食品或饲料内部或表面所含法律容许农药残留的最高水平。在食品中，典型的 MRL 约为pg/kg级(十亿分之一(ppb))，因此需要使用非常灵敏的仪器来检测化合物。对于红茶等含有多种内源性组分的食品尤其如此，因为这些内源性组分会造成严重基质效应。 本应用简报介绍了一种 LC/MS/MS 筛查方法，该方法可对复杂多样的食品基质中所含的244种农药进行检测和定量。将安捷伦农药全套测试混标分别加入有机红茶提取物和全橙提取物中。提取物按照下文所述的 Agilent QuEChERS 萃取和 EN 分散 SPE 方案制备。将 Agilent1290 Infinity ll液相色谱与6470B三重 四极杆 LC/MS联用，以动态多反应监测(dMRM)方法分析样品。6470B三重四极杆 LC/MS 进行了多方面的硬件改进，例如采用 VacShield 技术，离子源无需放空即可维护，有利于延长仪器正常运行时间；采用更快速的电子器件，具有改善的稳定时间参数，能够在极低的驻留时间下保证色谱峰重现性。 试剂与标准品 本研究使用了安捷伦农药全套测试混标(部件号5190-0551)。将农药全套测试混标的八种子混合物进行混合，然后用乙腈(ACN)稀释得到最终农药工作溶液，该溶液浓度为10 pg/g。将该溶液加入 QuEChERS 提取物中用于制备校准样品。为确定样品基质中的方法检测限(MDL)和定量下限(LLOQ)，使用红茶和有机橙样品提取物分别制备了7个浓度在0.5-100 ppb 之间的校准样品。 所有试剂和溶剂均为 HPLC 或 LC/MS 级。乙腈和甲醇购自 Honeywell (Morristown，NJ， USA)。超纯水产自配备 LC-Pak Polisher和0.22 um 膜式终端过滤器滤芯的 Milli-QIntegral 系统 (EMD Millipore， Billerica， MA，USA)。甲酸和甲酸铵购自 Fluka (Sigma-Aldrich 公司， St. Louis， MO， USA)。 样品前处理 有机散叶红茶和有机橙购自当地杂货店。用8mL水将2g茶叶样品润湿，并使样品在室温下温育2小时。利用陶瓷均质子(部件号5982-9312)制出充分混合的均匀橙子样品，并称取10g样品用于提取。用10 mL 乙腈通过剧烈振摇对2g固体茶样品和10g固体橙子样品萃取1分钟。分别向各混合物中加入一袋安捷伦 EN 方法萃取盐(部件号5982-6650)，振摇1分钟，然后在3000xg下离心5分钟。将6 mL 茶叶上清液加入用于高色素EN方法的Agilent QuEChERS 分散 SPE 管(部件号5982-5356)中。同样，将6mL橙子上清液加入用于含色素的水果和蔬菜EN的 Agilent QuEChERS 分散 SPE 管(部件号5982-5256)中。将两者振摇1分钟，然后在3000xg下离心5分钟。收集所得上清液，并通过 0.45 pm 针头过滤器过滤。将之前制备的农药工作溶液以相对原固体食物基质干重 100 ng/g (ppb)的浓度加入红茶和橙子提取物中。用适当的基质进一步稀释样品，获得0.5、1、5、10、20、50和100ppb 七个浓度水平的农药校准样品，需在进样前立即制备，每个浓度重复进样六次。将农药也加入纯乙腈中，比较10ng/g 浓度下两种基质的信号回收率。 设备 使用 Agilent 1290 Infinity ll液相色谱系统进行色谱分离，该系统由以下模块组成： Agilent 1290 Infinity I高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity II Multisampler，配备样品冷却装置 (G7167B，#100) Agilent 1290 Infinity ll高容量柱温箱(G7116B) 该液相色谱系统与配备安捷伦喷射流技术离子源(G1958-65638) 的 Agilent 6470B三重四极杆 LC/MS (G6470B)联用。分别使用 Agilent MassHunter 采集软件(版本10.1)和 MassHunter 定量分析软件(版本10.1)进行数据采集和分析。 方法 LC/MS 参数见表1。极性、母离子和子离子以及碰撞能能等 MRM 参数均从成熟的现有方法中复制而来，并针对所选的弱响应分析物优化了离子源条件。在快速极性切换 dMRM 模式下进行数据采集。将2 uL 最终提取物进样至 LC/MS 系统。使用忽略原点的线性拟合以及 1/x 加权进行校正曲线回归。 Agilent 1290 Infinity Ⅱl液普色谱系统 Agilent 1290 Infinity Ⅱl液普色谱系统 色谱柱 Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18，3.0×100 mm，1.8 pm (部件号959758-302) 柱温 40°℃ 进样量 2pL 自动进样器温度 4°C 进样针清洗 在冲洗口清洗10秒(75/25甲醇/H，0) 流动相 A)5 mmol/L 甲酸铵+0.1%甲酸水溶液 B) 5 mmol/L 甲酸铵+0.1%甲酸的甲醇溶液 流速 0.400 mL/min 梯度程序 时间 B(%) 0.00 50.50 52.00 4013.00 9814.50 9814.60 5 后运行时间 2 min Agilent 6470B 三重四极杆 LC/MS 离子源 安捷伦喷射流(AJS) 极性 正离子和负离子 气体温度 225°C 干燥气(氮气) 11L/min 雾化器气体 30 psi 鞘气 350°C 鞘气流速 12L/min 毛细管电压 3500 ±V 喷嘴电压 500±V 扫描类型 动态 MRM (dMRM) Q1/Q2分辨率 单位(0.7 amu) Delta EMV ±200V 碰撞池加速电压 3-7V 分析周期 500 ms 动态MRM 方法可实现快速分离 之前使用安捷伦LC/TQ仪器(型号G6470A)开发的多留留农药筛查方法可直接用于6470B三重四极杆 LC/MS 系统 (G6470B)。之前由于液相色谱柱和液相色谱系统不同，保留时间略有偏移，因此使用 MassHunter 软件的动态 MRM 更新选项自动调整所有农药的保留时间。图1显示了244种农药的叠加 MRM 色谱图，这些农药以1 ng/g 的浓度加标于 橙子提取物中，Y轴放大了弱响应农药的信号。使用14.5分钟液相色谱梯度，所有化合物的 MRM 色谱图都实现了基线分离。大部分农药的定量浓度为默认 MRL的 10%。 采集时间(min) 图1.244种农药的叠加 MRM 色谱图，这些农药以1ng/g的浓度加标于橙子中，Y轴放大了弱响应农药的信号 标准曲线分析 在红茶基质和橙子基质中，通过重复进样(n=6)7个浓度在 0.5-100 ng/g 范围内的校准品得到校正曲线，评估多残留农药测定的精密度和准确度。结果表明 获得了优异的分析精密度 (LLOQ及以上浓度下的相对标准偏差 (RSD)<20%)和平均准确度 (LLOQ及以上浓度下的计算浓度/预期浓度介于 80%-120%之间)。橙子提取物中所有244种农药和红茶提 取物中230种农药(共244种)的校正曲线的相关系数(R)均大于0.99。红茶中14种农药的低相关系数 R²(<0.99)反映出严重的基质效应。红茶基质中四种代表性农药的校正曲线如图2所示。 ×106 呋霜灵 ×104 赛唑隆 R2=0.9994 浓度(ng/g) 图2.红茶中加入的呋霜灵、赛唑隆、敌草隆和唑菌胺酯农药残留的校正曲线 在本研究中，6470B三重四极杆 LC/MS可以检出橙子基质中的所有农药(信噪比>3)，浓度均低于 10 pg/kg， 可用于筛查方案。而红茶基质中除了一种化合物(啶酰菌胺)外，其余所有化合物的残留量均小于或等于10 ug/kg。用校正曲线确定基质中各农药的 LLOQ， 定义为6次重复进样测得的最低浓度，峰面积的准确度介于 80%-120%之间， RSD 小于20%。图3显示了红茶基质和橙子基质中农药化合物的 LLOQ。改进后的6470B三重四极杆 LC/MS 系统可以定量红茶和橙子中的大多数目标农药，浓度低于欧盟委员会规定的默认 MRL 值 10 pg/kg4：红茶和橙子样品中，分别有239种农药(共244种)和243种农药(共244种)的LLOQ小于或等于 10 ng/g。对于 US-EPA规定的具有特定容差的化合物，其定量浓度均小于或等于 MRL 值。 食品基质回收率 图3.红茶和橙子中加标农药的 LLOQ 为评估基质效应(离子抑制和增强)，研究人员在 10 pg/kg 的默认 MRL 下，比较了基质与纯溶剂中的农药响应，并计算出农药回收率，如图4所示。橙子基质中大约有50%的化合物实现了 SANTE 指导原则要求的 80%-120%范围内的回收；红茶基质中大约有40%的化合物实现了这一范围内的回收。与预期一致，红茶基质相较橙子基质表现出更强的基质效应。因此，通常建议采用基质匹配校正曲线分析有严重基质效应的样品。由基质空白样品的分析结果可知，虽然原始红茶或橙子样品是从当地超市购买的“有机”产品，但它们仍含有12种农药。 140 回收率 图4.以默认 MRL值(10ug/kg) 加标到红茶和橙子中的农药回收率直方图 利用超高效1290 Infinity ll液相色谱系统与配备高灵敏度喷射流技术离子源 (AJS)的6470B三重四极杆 LC/MS联用的LC/MS 平台，评估食品基质中244种农药残留的定量性能。这套6470B三重四极杆 LC/MS 系统还增加了 VacShield 和经过改进的精密调谐的电子器件，易于维护且性能稳定，可实现长时间运行，同时保持极佳的稳定性和灵敏度。 本应用简报中使用了两种食品基质，红茶和橙子提取物。出人意料的是，在当地超市购买的有机产品中也含有一些合成农药。与纯乙腈相比，两种食品基质的在分析物响应方面的差异均表现出明显的基质效应。即使在复杂基质中，也有超过98%的目标农药(共244种)的 LLOQ处于或小于欧盟委员会规定的默认 MRL值10 pg/kg， 证明该 LC/MS 平台具有高灵敏度。根据基质中的农药响应与纯乙腈中的农药响应计算化合物回收率。橙子基质中大约有50%的化合物实现了 SANTE指导原则要求的 80%-120%范围内的回收；红茶基质中大约有40%的化合物实l现了这一范围内的回收。 1. ( Title 7 U.S. Code of Federa Regulations - Part 205.US-EPA. https：//www.ecfr.gov/ Retrieved 9April 2020 ) SANTE/12682/2019 EuropeanCommission.https：//ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/pesticides_mrl_guidelines_wrkdoc_2017-11813.pdf Retrieved20 April 2020 ( Title 40 U.S. Code of Federal Regulations- Part 180. US-EPA.https：//www.ecfr.gov/ Retrieved 9April 2020 ) ( Regulation (EC) No 396/2005.European Commission.https：//ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database/public/Retrieved 9 April 2020 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com DE.6638541667 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 本应用介绍了一种利用 Agilent 6470B 三重四极杆 LC/MS 系统检测食品基质中244 种农药残留的 LC/MS/MS 筛查方法。有机橙子和红茶由于所含成分复杂，因此被选择用于评估该方法检测食品基质中农药残留的性能。在橙子基质中，除一种目标农药外，其余所有目标农药均可在小于或等于欧盟委员会规定的默认最大残留限量 (MRL) 10 μg/kg 的水平被检出。在浓红茶基质中，239 种农药可在小于或等于10 μg/kg 的浓度被检出。研究人员还研究了基质效应对分析物响应的影响，结果表明，橙子基质和红茶基质中分别有 50% 和 40% 的农药可在 SANTE 指导原则要求的范围内 (80%–120%) 得到回收。这些结果证明，6470B 三重四极杆 LC/MS 可满足高灵敏度要求，能够对食品基质中的农药进行准确、精密地定量分析。