饲料中赖氨酸检测方案(二手分析仪器)

高效液相法测定饲料中低含量赖氨酸的方法 郑凝坚 (广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东广庆526060) 摘 要：采用高效液相方法能快速、准确，低消耗地测定出氨基酸混合样品中较低的赖氨酸含量。测定条件是： ODS色谱柱，检测波长250nm， 柱温35℃。流速：2.2ml/min， 进样体积：10uL，采取I9AA氨基酸标准液柱前衍生方法测定。操作显示：对于低含量的多种氨基酸混合物及发酵液中液氨酸含量测定，其专属性(分离度>1.5、线性回归相关系数0.99995，重复性RSD≤1.0、精密度 RSD≤1.0、回收率99.5~100.5%。结果表明，该方法简便、灵敏度高，线性关系好，能在饲料中准确检测出含量较低的赖氨酸等其他混合物中氨基酸含量。 关键词：高效液相；快速测定混合样品；混合饲料；低含量赖氨酸；柱前衍生 中图分类号：S816 文献标识码：A 饲料添加剂赖氨酸硫酸盐是近些年开发的新产品。相对于高纯度的赖氨酸盐酸盐产品而言，低含量赖氨酸有许多优点：生产成本更低；动物喂养效果更好；克服环保难题等等。目前产品市场需求最很大。 对于饲料添加剂各种较低含量的赖氨酸硫酸盐产品，目前国内外尚未有适用的国家标准和行业标准，而其中所含有的多种氨基酸杂质也会对检测造成影响。目前最准确的方法是采用氨基酸分析仪进行测定。但由于很多企业尚未有这种较专用的仪器。因此采取高效液相进行柱前衍生法分析氨基酸含量，可以有效地将样品各种的氨基酸有效分离，准确地测定前赖氨酸的含量，发挥 HPLC更大作作用。方法经验证其准确度、线性、精密度等符合使用要求。 1实验部分主要仪器及试剂 HP1100高效液相色谱仪(安捷伦科技)，酸度计(奥立龙868)，电热鼓风干燥箱(重庆四达)。分析天平(赛得利斯)19AA氨基酸标准溶液 (Waters)， DL-2氨基丁酸，三水合乙酸钠，磷酸，，三乙胺、盐酸等。 1.2 实验方法 1.2.1 样品制备 取待测样品适量，精密称定，加水适量稀释，加内标物贮备液适量，配制成赖氨酸浓度在 0.5 mmol/L左右、内标物浓度为0.5 mmol/L的供试品溶液，摇匀，得样品溶液，备用。 1.2.2对照液的配制 取a-氨基丁酸适量，精密称定，加水溶解成浓度为25mmol/L的内标溶液。取赖氨酸标准品及各杂质氨基酸标准品适量，精密称定，加水适量溶解，加内标物贮备液适量，配制成赖氨酸标准品浓度为 0.5mmol/L、各杂质氨基酸标准品浓度为 0.05pmol/L、内标物浓度为 0.5mmol/L的对照品溶液，摇匀，得对照品溶液。 1.2.3 色谱条件及系统适用性试验 进样体积：10ml 流速：2.2ml/min 柱温：35℃ 检测波长：250mm 梯度洗脱表：见表2。 表1 梯度洗脱表 时间(min) 乙腈(%) 醋酸钠缓冲液(%) 水(%) 0.00 5.0 95.0 0.0 9.00 5.0 95.0 0.0 13.00 4.0 96.0 0.0 21.00 17.0 83.0 0.0 24.00 20.0 80.0 0.0 25.00 50.0 0.0 40.0 26.00 50.0 0.0 40.0 26.01 5.0 95.0 0.0 28.00 5.0 95.0 0.0 取系统适用性溶液进样，理论板数按天冬氨酸峰计算，应不低于3000；各氨基酸组分之间最小分离度应不小于1.5。运行分析过程中，应定期进Ⅰ针系统适用性溶液，以确保色谱系统稳定。 1.2.4 操作步骤 准确吸取系统适用性溶液、对照品溶液或供试品溶液各10pl，分别置于内插管中，加人硼酸缓冲液70pl，涡旋条件下加几衍生溶液20ul， 室温下放置 lmin， 用石蜡膜封口。将内插管置55℃恒温干燥箱中加热 10min(使酪氨酸次级副产物尽快转化为单衍生主要成分)，然后将内插管置样品瓶中，用硅胶垫盖旋紧。另准确吸取硼酸缓冲液80pl于内插管中，涡旋条件下加加衍生溶液20gl，室温下放置 lmin， 然后将内插管置样品瓶中，用硅胶垫盖旋紧，得空白溶液。取对照品溶液、供试品溶液依次进样，记录色谱图。按内标法以峰面积计算赖氨酸和其他氨基酸的含量。 2结果与讨论219种氨基酸的分离效果图 按上述方法进样后，得到19种氨基酸的标准色谱图如图1所示。 图1 氨基酸专属性图谱 由图1可以看出，所选用的方法能将19种氨基酸有效分离。内标物与赖氨酸峰，以及各相邻氨基酸峰之间的分离度均>1.5。 2.2 线性和检测限、定量限 称量5个不同浓度的标准品溶液，范围为20~120%，得到的线性范围在0.5~730ng/ul。相关系数：0.99995。 按信噪比2.0倍，得到的检测限(LOD) 为 0.03ng/ul。按信噪比10倍，得到的定量限(LOQ) 为0.15ng/ul。 2.3 重复及精密度试验 由两分析员分别配制6个样品，进行分析。同一分析员测定结果的RSD≤1.0、不同分析员间的精密度 RSD≤1.0。 2.4 回收率 往已知含量的发酵液中加入四种量的赖氨酸对照品，将测定结果与真实结果比较，单个回收率>85%，平均回收率为99.6。 取一批玉米浆，加入4种量的赖氨酸对照品，混合均匀后检测。将测定结果与真实结果比较，单个回收率>95%，平均 (上接第2页) 子萌发、形态，以及厚朴的不同炮制方法等方面研究的较多，然而很少涉及不同地区、不同海拔厚朴生长情况以及其药用活性成分对比研究的比较少。 表2不同海拔高度的厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的含量测定结果 海拔/m 厚朴酚含量(%) 和厚朴酚含量(%) 总量(%) 1000 2.2713 0.3714 2.6427 1200 2.5624 0.3954 2.9578 1400 2.8413 0.4216 3.2629 本实验从一个崭新的角度阐述了厚朴在不同海拔生长状况的差异，不同的海拔高度由于其空气、温度、光照等诸多因素的影响，厚朴在1200米的海拔生长最为旺盛。然而，厚朴酚与和厚朴酚产量与海拔成正相关的关系。可能是由于高海拔地区，厚朴生长缓慢，更有利于厚朴酚与和厚朴酚的积累。这个发现，对提高厚朴今后的种植、开发具有重要的意义。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 龚建 明 ，林勇 . 厚朴的现代研究与进进[J]. 东 南国防医药，20 08 ( 02 ) ： 1 25 - 126. ) ( [2]陈 笈 ，王伯初.厚朴的药理研究进展[ J ] .重庆大学学报(自然科 学版)， 2 0 05( 0 9 ) ：1 4 0 - 1 43 . ) ( [3]张永太，吴 皓 .厚朴药理学研究进展[J ]. 中国中医药信息杂志， ) 回收率为100.1%。 3结 论 低含量的赖氨酸作为新型的饲料添加剂，现正得到普遍的使用。对于传统经典的氨基酸测定法一般是采用氨基酸分析仪。但对于作为饲料添加剂的赖氨酸产品由于初期投人太大。因此采用各实验室普遍都已有的高效液相色谱仪检测，用此方法检测，经验证可实现一机多用，达到准确有效的质量监控。 ( 参考文献 ) ( [ 1 ]分析方法验证.中 国 药典[M]. 2 01 0. ) ( [2] W a te r s 公司. A c c Q. Tag 氨基酸分析方法[ C ] . ) ( 作者简介：郑 凝坚( 1 9 70 -)，女，广东省 肇 庆市 ， 工程师， 本 科 。 研究方向：化工，药品。 ) ( 2 005( 0 5 ) ：96 -9 9. ) ( [ 4 ]卫莹芳，龙飞，谢达温，等.厚朴叶和皮不同提取部位的药理作用比较研究[J ] . 天然 产物研究与开发，2 0 0 7( 05) ： 7 7 2 - 7 7 5 . ) ( [5]任坚忍，余凡，张诗蓓 ， 等. 厚 朴活性成分研究进展 [J].现代农 业科技，2 0 1 1(2 1 )： 127- 1 28. ) ( [6]林桂芸，谢生发，谢鸿，等.和厚朴酚抑菌作用的研究[ J] .成都大学学报(自然科学版)，2003 (02 ) ： 1 8 - 2 0 . ) ( [7]殷帅文，何旭梅，郎锋祥，等，厚朴化学成分和药理作用研究概 况 [ J ] . 贵州农业科学，20 0 7 (06 )： 1 33-1 3 5， 13 2. ) ( [8]李晓琳，邵爱娟，陈敏，等.道地产区不同产地厚朴种子的电泳指纹图谱研究 [J] . 中 国 中药杂志，201 1 ( 22 ) ：3 07 5-3 0 78. ) ( [9]杨永康，向极钎，刘海华， 等 .恩施地道药材 GA P 基地建设与药业产业发展中的问题及对策[J] . 安徽农业科学，2011 ( 3 2) ：2012 0 -2 0121 . ) ( [1 0]杨华，张 兴 友，向青， 等 .凹叶厚朴生长与立地因子关系研究 [ J ] . 四川林业科技，2 0 1 1(0 5 )： 8 8- 9 0. ) ( [ 1 1]尹奉 月 ，低质低效林改造经营项目的示范作用研究[ J ].林业 建 设， 2 0 08( 0 4) ： 2 5-2 7 . ) ( [ 1 2]孙晶波，满东斌，李双 池 .加强森林抚育、低效林改造是提高森林质量的有效途径[J]. 防 护 林科技，200 5(03 ) ：48-5 0 . ) ( 作者简介：庄 国庆(1 97 7-)，男，博士，助理研究员 ， 研究方向：林木遗传育种和栽培生理。 ) ded 滴 Drdrdr AGRICULTURE AND LTECHNOLOCY 采用安捷伦1100高效液相方法能快速、准确，低消耗地测定氨基酸混合样品中交低的赖氨酸含量。测定条件：ODS色谱柱，检测波长250nm，柱温35℃，流速：2.2ml/min，进样体积：10μl，采取19AA氨基酸标准液柱前衍生方法测定。操作显示：对低含量的多种氨基酸混合物及发酵液中赖氨酸含量测定，其专属（分离度＞1.5，线性回归系数0.9995，重复性RSD≤1.0，精密度RSD≤1.0，回收率99.5-100.5%）。结果表明，该方法简单，灵敏度高，线性关系好，能在饲料中准确检测出含量较低的赖氨酸等其他混合物中氨基酸含量。