血浆及尿液中异烟肼检测方案(液相色谱仪)

色 谱CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY第20卷第5期2002年9月Vol.20 No.5September 2002 第5期金 鸣等：反相高效液相色谱法测定血浆及尿液中的异烟肼443 反相高效液相色谱法测定血浆及尿液中的异烟肼 金 鸣1， 黄河2， 陈新山1 (1.华中科技大学同济医学院法医学系，湖北武汉430030； 2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北武汉430030) 摘要：建立了血浆及尿液中异烟肼的高效液相色谱快速测定方法，以满足临床药物分析和法医学鉴定的需要，提高对血浆及尿液中异烟肼浓度检测的准确性。以香草醛为衍生化试剂，将异烟肼经柱前衍生为异烟肼-香草醛腙，直接对处理后样品中的腙进行定性、定量分析。以在空白人体液样本中定量添加标准异烟肼的方法考察了样品的前处理方法、仪器条件、线性范围、精密度、回收率等，并对健康受试者血液中的异烟肼浓度进行了监测。结果表明，方法的线性范围为 0.2 mg/L~12.0 mg/L；检测限为0.2 mg/L；日内、日间精度均小于4.0%(n=5)；回收率在96.3%以上。该方法快速、准确、实用，适用于临床药物浓度监测、法医毒物分析和药代动力学等相关研究。 关键词：高效液相色谱；异烟肼；血浆；尿液 中图分类号：0658 文献标识码：A 文章编号：1000-8713(2002)05-0442-04 Determination of Isoniazid in Blood and Urine Samples byReversed-Phase High Performance Liquid Chromatography JIN Ming'， HUANG He， CHEN Xin-shan (1.Faculty of Forensic Medicine， Tongji Medical College，Huazhong Science and Technology University，Wuhan 430030， China； 2. Affiliated Tongji Hospital， Tongji Medical College， HuazhongScience and Technology University， Wuhan 430030，China ) Abstract： For the purpose of more accurate and rapid analysis of isoniazid in body fluid samples， areversed -phase high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed. Vanillin，being as a derivatizing reagent， was added to the plasma and urine samples when they were pretreated.Isoniazid and vanillin reacted to form isonicotinoyl hydrazone which was separated and detected. Thepretreatment method of sample， the linear range， the precision， and the recovery of isoniazid wereinvestigated by using human’s plasma and urine spiked with standard isoniazid. The linear range was0.2 mg/L-12.0 mg/L (for plasma， r=0.999 6； for urine， r=0.999 4). The detection limit was0.2 mg/L. The intra-day and inter-day precisions of assay for isoniazid were 2.3%-2.6% and 3.8%-4.0%(n=5) for plasma， 1.3%-4.0% and 2.1%-3.9%(n=5) for urine respectively. Theaverage recoveries of isoniazid were from 96.5% to 99.8% in plasma and from 96.3% to 99.4% inurine. The HPLC method has been used to investigate the concentration of isoniazid in the volunteer’splasma. The quantitative analysis of isoniazid in plasma was not interfered by impurities， themetabolites of isoniazid and the derivatizing reagent residue. This analytical method for isoniazid issensitive rapid and convenient. It is suitable for the analysis of toxics in forensic samples， thedetection of drug concentration in clinical medicines and pharmacokinetic studies. Key words： high performance liquid chromatography； isoniazid； plasma； urine 异烟肼(isoniazid，INH， 又称雷米封)是临床上抗结核病的首选药物之一。INH毒副作用较大11，仅在治疗量范围内使用也容易发生急性或蓄积性中毒。近年来，我国结核发病率明显上升，对 INH等抗结核药物的使用也随之增加，由此引发的中毒、死 亡及医疗纠纷案件也随之增多。所以 INH 中毒在临床药(毒)物分析中占有较重要的位置。有关INH中毒检验与临床药物浓度监测的色谱分析方法较多，如薄层色谱法[2]、气相色谱法[3.4]、液相色谱法5~10]等。但大都面临提取率低、操作繁琐的问 ( 收稿 日期： 2 0 01-12-12 ) ( 作者简 介 ：金 鸣，女 ， 1959年生，理 学 士，副教授，电 话 ： ( 027)836578 8 9，83692648， E-mail： Jinming622@sina. c om. ) 题。其中有些方法只适用于对原药中的INH成分进行分析或对致死量血药浓度测定，难以满足治疗量下对血液、尿液中 INH 浓度进行快速检测的要求；有些分析方法还必须使用特殊的仪器或试剂，在一般的药(毒)物分析实验室难以实施。因此，为满足临床血药浓度监测和法医学鉴定中准确、快速、便捷的需要，我们对 INH 体液样品的前处理方法和高效液相色谱(HPLC)检测方法再次进行了研究，建立起一个实用的分析方法，并以所建方法对健康受试者血液中的 INH浓度进行了24h全程监测及尿液中 INH 的单样品测试，测定结果理想。 1实验部分 1.11仪器与试剂 日本岛津 LC-1型高效液相色谱仪，色谱工作站， TGL-16G 台式高速离心机。 INH标准品购自公安部第二研究所(纯度为99.0%)。香草醛、三氯醋酸、三乙胺、高氯酸、甲醇和磷酸二氢钾均为国产分析纯。去离子水经双蒸后使用。衍生化试剂为 16 g/L 香草醛甲醇溶液。 1.2 INH标准溶液的配制 准确称量 INH标准品10.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到1.0 g/L INH的标准贮备液。移取标准贮备液5.0 mL 稀释至10mL，配制成为500 mg/L的 INH标准溶液备用。 1.3 血浆、尿液样品的采集 抽取健康人静脉血，经高速离心(3000 r/min×10 min)，吸取血浆于-20℃冷冻保存，作为空白血浆样品备用。 健康受试者单剂量口服异烟肼后，在24h 内分12个时间段分别抽取静脉血5.0 mL，离心(3000r/min×10 min)，取血浆于-20℃冷冻保存，作为INH 血液浓度代谢样本待测。 取健康人尿液作为空白尿液备用。取健康受试者尿液作为 INH 尿液代谢样本待测。尿液于-20℃冷冻保存。 1.4 血浆、尿液样品的前处理 取血浆样本0.25mL置于1mL离心试管中，加入100 g/L三氯醋酸 50 uL，16 g/L 的香草醛溶液40uL，然后加甲醇至总体积为0.5 mL。将上述溶液于40℃水浴反应20 min，冷却，高速离心(10000 r/min×5 min)，吸取上清液20 uL进样，外标法定量。 取尿液样本，使用前离心(5000 r/min×10min)，吸取上清液0.25 mL，其后样品前处理操作同血浆。 1.5色谱条件 色谱分离柱：YWG-Cg柱(4.6mm i.d.×200mm)；预柱：YWG-C8柱(6mm i.d.×25 mm)；流动相：V(0.02mol/L KHPO)：V(CHOH)=61：39，每 500 mL 流动相加入体积分数为70%的 HCIOA0.2 mL及体积分数为20%的三乙胺0.4 mL；检测波长：340 nm；流速：1mL/min；进样量：20pL. 2结果 2.1标准工作曲线、线性范围和检测限 取空白血浆及空白尿液各6份，每份0.25 mL，分别加入入度为 500 mg/L的INH标准溶液0.2pL，0.8pL，2.0 pL，4.0 pL，8.0 pL和 12.0 pL；再分别加入100 g/L三氯醋酸 50 pL 和16 g/L香草醛溶液 40 pL，加醇醇至0.5 mL，配制成质量浓度分别为0.2 mg/L，0.8 mg/L，2.0 mg/L，4.0 mg/L，8.0mg/L 和 12.0 mg/L 的 INH血浆及尿液样本(平行操作的样本数为5)。按样品处理方法处理后，在上述色谱条件下，分别进样20pL，测出其峰面积。将峰面积(Y)对样品的质量浓度(X， mg/L)进行线性回归，结果见表1。 表1血浆、尿液中异烟肼的回归方程、线性范围、相关系数及检测限(n=5) Table 1 The regression equations， linear ranges， correlationcoefficients and the detectable limits of isoniazidin plasma and urine(n=5) Linear Correlation coefficient Detectable Sample range (mg/L) Regression equation* limit (mg/L) Plasma 0.2-12.0Y=2.93×10X-9.30×10 0.999 6 0.2 Urine 0.2-12.0Y=3.54×10X-1.17×105 0.999 4 0.2 *X is the mass concentration of isoniazid， mg/L；Y is peak area. 2.2 精密度试验 取浓度为0.8 mg/L，4.0 mg/L(或8.0 mg/L)和12.0 mg/L的3个标准血浆和尿液样本的提取物，分别于同1d内5个不同时间点及不同日内连续测定5d，由测得浓度计算标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)，获得日内、日间精密度值，结果见表2和表3。所得 RSD 均在4.0%以内，精密度符合要求，测定方法可靠。 表2 血浆中异烟肼测定的精密度(n=5) Table 2 The precision of determination of isoniazidin plasma(n=5) o(isoniazid) Intra-day Inter-day (±SD) RSD (±SD) RSD (mg/L) (mg/L) (%) (mg/L) (%) 0.8 0.79±0.02 2.6 0.79±0.03 3.8 4.0 3.85±0.10 2.6 3.89±0.15 3.9 12.0 12.52±0.29 2.3 11.76±0.47 4.0 Table 3 The precision of determination of isoniazid in urine (n=5) o(isoniazid) Intra-day Inter-day (±SD) RSD (±SD) RSD (mg/L) (mg/L) (%) (mg/L) (%) 0.8 0.80±0.01 1.3 0.77±0.03 3.9 8.0 7.73±0.10 1.3 7.67±0.16 2.1 12.0 12.08±0.48 4.0 11.28±0.44 3.9 2.3 回收率的测定 配制 INH 质量浓度分别为 0.8 mg/L， 4.0mg/L，8.0 mg/L和12.0 mg/L的血浆及尿液样本，经样品前处理后在“1.5”节所述色谱条件下进行分析(n=5)。由测得质量浓度计算回收率，结果见表4和表5. 表4 血液中异烟肼回收率测定结果(n=5) Table 4 The recovery of isoniazid in plasma (n=5) Added Found Recovery RSD (mg/L) (mg/L) (%) (%) 0.8 0.79±0.03 98.8±3.3 3.3 4.0 3.86±0.20 96.5±3.9 4.0 8.0 7.98±0.32 99.8±3.5 3.6 12.0 11.76±0.52 98.0±3.8 3.9 表5尿液中异烟肼回收率测测结果(n=5) Table5Therecovery of isoniazid in urine (n=5) Added Found Recovery RSD (mg/L) (mg/L) (%) (%) 0.8 0.78±0.03 97.5±4.0 4.1 4.0 3.89±0.13 97.3±3.2 3.3 8.0 7.70±0.16 96.3±2.0 2.1 12.0 11.93±0.44 99.4±3.9 3.9 血浆及尿液中 INH 的回收率均在96.3%以上，符合定量分析的要求。 2.4 INH的高效液相色谱图 图1和图2是在"1.5”节所述色谱条件下得到的谱图。 图1 血浆样本的色谱图 Fig.1 (Chromatogram of plasma1. isoniazid (6.63 mg/L). 图22尿液样本的色谱图 Fig.2 Chromatogram of urine1. isoniazid (8.74 mg/L). 3 讨论 3.1 样品的前处理条件选择 INH与香草醛的柱前衍生化反应为9，10]： 反应于40℃水浴加热20 min 可1：1定量完成，产物是 INH-香草醛腙。 INH 极性较大，难溶于有机溶剂，不能用有机溶剂直接从生物样品中提取出来。腙是一个弱极性化合物，易溶于有机溶剂，可用乙酸乙酯、氯仿、氯仿-乙醚等有机溶剂萃取。因此，衍生物腙可以用适宜的有机溶剂萃取后检测或不经萃取直接吸取上清液对腙进行色谱分析。实验表明，对于血浆和尿液中的INH-香草醛腙，高速离心后直接取上清液进行HPLC检测，其回收率明显高于用有机溶剂对腙萃取后再进行检测的方法。 3.2 流动相的选择 实验中分别对以下不同组成的流动相进行了考察：①V(0.02 mol/L KH PO)：V(CH，CN)=55：45；②V(0.02 mol/L KH，PQ)：V(CH，CN)=70：30；③V(0.02 mol/L KHPO)：V(CHOH)=60：40；④V(0.02 mol/L KHPO)：V(CH，OH)=61：39，每500 mL 流动相中加入0.2 mL 70% HCIO和0.4 mL20%三乙胺。 在流动相为①的条件下，衍生物腙与过量的香草醛都出峰太快，二者分离不完全；在流动相为②与③的条件下，腙先流出色谱柱，其次是过量的香草 醛，这样不利于操作和观察；在流动相为④的条件下，色谱峰峰形好、分离完全，过量的香草醛与衍生物腙依次流出色谱柱，保留值分别为香草醛8.45min， 腙 11.09 min，因此选定流动相④。 3.3 实际应用 健康受试者10人，男性，25岁~36岁，体重55kg~67 kg，单剂量口服国产异烟肼片剂 250 mg，于服药后0 h，0.33 h，0.67 h，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，7h，9 h，12h和24h12个时间点分别抽取静脉血，测定 24h 内血液中异烟肼质量浓度的变化。INH血液浓度随时间的变化曲线见图3. 图3 异烟肼的代谢曲线 Fig.3 The pharmacokinetic curve of isoniazid in blood 测定结果显示：该方法灵敏度高、选择性好，足以满足治疗量范围内的测试要求。在全程监测的时间范围内，测试不受内源性杂质、INH代谢成分及过量衍生化试剂的干扰。 我们还对常与之同用的利福平、吡嗪酰胺两药物进行了干扰测试，在“1.5”节所述色谱条件下，无利福平、吡嗪酰胺色谱峰出现。所以该方法可在利福平、吡嗪酰胺同时存在的情况下对血浆、尿液中的INH进行定性、定量分析。测试尿液样品时，应视样品中药物含量对尿液适当稀释。 ( 参考文献： ) ( [1 ] J IA O Xiao-ling， YANG Y u -z h ang， WANG J i -min， WA N G Xiao-miao， XIAO Yue-p i ng， AI Min， R E N Li - Ping， MA E n -bo， Y A N G Zh an -bin. 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