中药及天然药中药用植物分析检测方案(ICP-MS)

珀金埃尔默中药及天然药用植物分析文集 结论 For the Better 目录 1.ICP-MS测定糖尿病人药膳常用中药中的微量元素. 1 2.ICP-MS分析啤酒花中的有毒和营养元素. ..17 3.药用工业大麻中重金属的消解、测定和方法验证 .10 4.GC-FID 和 GC-MS定性定量分析药用工业大麻中的活性成分 .四氢大床酚和大麻二酚... .15 5.满足农药残留和真菌毒素监管要求的工业大麻液质联用分析方法，....... .21 6. HPLC测定人参根茎中的皂苷.......... ..31 7.中药黄连的红外光谱快速质量控制. .34 8.正红花油指标成分的红外光谱定量分析... ..37 与糖尿病的发生。另一方面糖尿病患者因分泌代谢紊乱，一些能参与调节血糖的微量元素表现出明显的不足或下降。因此，必须有较高的摄入量才能满足机体代谢的需要。已有不少研究表明，糖尿病与环境因素、饮食结构和生活习惯因素中的微量元素密切相关。如铬(Cr)， 锌(Zn)， 锰(Mn)，硒(Se)等与糖尿病的发生、发展、并发症的产生等有一定关系[。中华药膳是药物和食物有机结合的产物，具有广泛的民间基础。糖尿病常用药膳所用的材料涉及多种中药和食物，其中许多药膳材料富含多种微量元素13。 用电感耦合等离子体质谱(inductively coupledplasm a mass spectrometry，ICP-MS)测定中草药中微量元素具有快速，准确，灵敏度高，选择性好及多元素同时测定等优点，比其他分析技术更具优越性，是公认的较好的微量元素分析方法[4]。作者采用微波消解技术处理样品I，利用 ICP-MS 测定了川贝母等13种糖尿病药膳治疗常用中药的微量元素含量。通过比较糖尿病药膳治疗常用中药所含的铬(Cr)，锌(Zn)，锰(Mn)， 硒(Se)， 铜(Cu) 和钒 (V)6种元素含量，探讨各种微量元素与其降血糖活性的关系，为药膳或中药治疗糖尿病提供实验依据， 并为其药理研究提供参考。 1.1仪器、试剂及样品 ICP-MS 为美国 PerkinElmer 产品；微波消解系统为美国 CEM 公司产品。实验中所用玻璃器具均在10%硝酸中浸泡48h后，再分别用蒸馏水和超纯水冲洗干净。 实验中所使用的 HNO3， H202， HF 均为分析纯或优级纯含Cr，Mn， Cu， Zn， Se 和V的准准储备溶液，各元素的质量浓度均为 10 ug·mL， 购自美国PerkinElmer。 一个有效的近红外方法能够有效地辨别出真实/符合规定的材料与假劣或超出规格的材抹。主成份分析数据的化学计量学建模必须做到这一点。一旦模型开发了，能够为一个训练有素的技术人员操作的常规分析所需的最低操作技能也应建立。对未通过的样品进行调查和驳回，通过了的样品则批准进行进一步的测试。这样减少了不符合标准的材料进一步测试的昂贵费用。 实验中分析测定用的13种中药样品均购于本地药店，经厦门大学生命科学学院叶庆华教授鉴定，包括舌川贝 母 Fritilla ria cirrhosa D. Don.， 知]1母Anemar-rhena asphodeloides Bge.，麦 冬Ophiopogon japonicus (thunb.) Ker-Gawl.，党参Codonopsis polosula (Franch.) Nannf.， 葛根 Pueraria lobata (Willd.) Ohwi，黄 芪 Astragalusmembranceus (Fisch.) Bge.var. mongholicus(Bge.) Hsiao， 桑叶Morus alba L.， 山楂 Crataeguspinnatifida Bge.，生地黄Rehmannia glutinosaLibosch.， 熟地黄R. glutinosa Libosch.，太子参Pseudostella ria heterophylla (Miq.) Pax ex Paxet Hoffm.， 天花粉 Trichosanthes kirilowii Maxim.和口薏苡仁 Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen(Roman.) Stapf.. 1.2样品含水量测定 所购样品于80±0.5℃干燥3~4h，粉碎后过80目筛，在100±0.5℃干燥至恒重，计算各样品的含水量。实验中所获数据均以样品的干重 (DM) 为基准。 1.3样品处理方法 精密称取已烘干的样品 0.2g， 放入消解罐中。分别加入5mL HNO3，1mLH20和0.1mLHF。加盖密闭后，置于微波消解炉中，按特定的微波消解程序进行消解(5min 内微波消解炉内温度由室温升至120℃，保持 10 min。随后在 5 min 内线性升温至180℃， 并在180°℃下继续消解10 min)。消解完全后，将样品的消解液转入 50mL 量瓶中，用少量水洗罐3~4次，用超纯水定容至刻度，混匀，待测。同时，加入5mL HN03， 1mLH20和 0.1mLHF到消解罐中，用同样方法制备样品空白溶液。每种样品和空白制备一式3份。 1.4绘制标准工作曲线 精密吸取一定量的质量浓度为 10ug·mL含有 Cr，Mn， Cu， Zn， Se 和V6种元素的标准储备溶液，用超纯水稀释配制质量浓度为0， 10，20， 40 ug·L的标准溶液。上 ICP-MS分析，获取各种样品相应浓度的系列测定值。以测定值为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，由此求得 1.5重复性和准确性试验 准确称取川贝母粉末 0.2g，按1.2项样品溶液制备方法操作， ICP-MS测定6种微量元素含量，平行实验5份，计算各元素含量平均值及 RSD。 为检验实验所选的样品处理方法和测定方法的准确性，选用知母和葛根两种样品进行加标回收率测定。分别取干燥的知母和葛根粉末 0.2g， 置于微波消解罐中，加入消解液 (5mL HNO3，1mLH202和0.1mL HF)， 再精确加入适量的质量浓度为 10 ug·mL含有 Cr，Mn，Cu，Zn，Se，V6种元素的标准储备溶液，以1.2项同样的消解方法制备加标的样品溶液。然后用 ICP-MS 测定加标后样品溶液的6种微量元素的含量，计算各元素的加标回收率及 RSD。 1.6样品测定 利用 ICP-MS 在选定的测量条件下对1.2项所制备的13种样品溶液中的 C， Mn， Cu， Zn， Se， V含量进行测定。每种样品各做3个平行实验，经过统计，得出各元素的含量均值。 2.1测试方法的可行性 根据 ICP-MS 测定的系列标准溶液所获得的数据绘制而得的6种元素的标准工作曲线，其线性关系良好，相关系数均大于0.999，表明可用于实际的样品浓度的分析测定。 经统计分析，以川贝母为例验证方法的重复性实验中，Cu，Zn，Cr，Mn，V5种元素的RSD分别为 3.94%，9.27%，6.70%，4.22%，3.62%(元素未检测到)。由此可见，5种元素的 RSD 均≤9.27%，表明采用本法测定的重复性很好，符合痕量分析的要求。 实验以葛根和知母为例测定了6种元素的加标回收率，测定结果见表1。由表可见，6种元素的回收率都在88.2%~110.00%， RSD 均在6.98%以内，说明本实验所采用的方法是可行的，实验数据准确、可靠。 表16种元素加标回收率 元素 原含量 加入量 测得值 回收率 RSD ug.L /ug.L /ug.L /% /% Cr 5.51 1.00 6.50 99.00 4.96 Mn 22.84 25.00 48.80 103.84 5.59 Cu 12.51 25.00 38.30 103.16 1.53 Zn 13.65 25.00 35.83 88.72 1.00 Se 1.55 1.00 2.51 96.00 6.10 V 3.80 1，00 4.90 110.00 6.98 2.2样品微量元素含量 川贝母、知母等13种药膳治疗常用中药的6种微量元素含量测定的结果见表2。由表2可知， Cr， V2种元素在13种样品中含量的差别规律相似，都以生地黄和熟地黄含量最高，熟地黄含 Cr和V最高，分别为11.82，12.04 ug.gl生地黄次之，含 Cr量为6.72ug·g， V为 2.84ug·g。在13种样品中，上述6种微量元素 Mn 含量较高，且差别最大(4.36~564.30ug·gl)。其中桑叶最高，太子参次之，分别为564.30，555.07 ug.g。麦冬、葛根和天花粉较低，约在4.36~6.63ug·g。Cu 含量在这些样品中变化不大，约在0.55~13.34ug·g1，除太子参中含量高达13.34 ug·g外，多数在5~9ug·gl。 Zn 在不同的中药样品中有较大差异，麦冬(3.19ug·gl)、葛根 (3.47 ug·gl)含 Zn 量较少，知母最多 (86.23 ug·gl)， 其次是薏苡仁 (40.35ug·gl) 和山楂 (25.12ug·g')。党参、黄芪、桑叶和太子参的 Zn含量则在11.37~18.07 ug·g。 Se仅在知母、麦冬、葛根、山楂、生地、熟地和薏苡仁中被检测到，且含量均较低。知母含 Se 最高，仅0.39ug.g，同时，表2数据也显示，样品之间在被测元素的含量及检出值上存在着较大的差异。例如，生地黄、熟地黄所含微量元素较高，前者的Cu， Zn 含量略高于后者，而后者含 Cr， Mn， Se，V相对较高些。生地黄和熟地黄均为玄参科地黄的根， 只是加工方式有些不同，这可能是其微量元素含量差异的原因之一。桑叶、太子参未检到 Se 元素，但其余5种元元含量较为丰富，两者的 Mn 含量是13种样品中最高的。川贝母、麦冬和知母都是百合科植物的根茎，三者的微量元素含量有一定的差异，其中知母的6种微量元素含量均高于川贝母和和冬。 表213种中药样品微量元素含量 样品 Cr Mn Cu Zn Se V 川贝母 9.14 0.55 4.32 0.05 知母 1.40 9.99 5.81 86.23 0.39 0.96 麦冬 0.89 4.36 6.38 3.19 0，10 0.26 党参 2.09 151.40 6.80 11.85 0.48 葛根 0.23 5.81 3.18 3.47 0.02 0.19 黄芪 0.91 11.57 6.27 11.37 0.32 桑叶 2.29 564.30 5.00 12.81 1.45 山楂 0.95 8.87 9.23 25.12 0.05 0.22 生地 6.72 174.90 6.13 8.46 0.32 2.84 熟地 11.82 239.67 5.87 7.10 0.36 1204 太子参 3.47 555.07 13.34 18.07 0.62 天花粉 1.25 6.63 8.42 8.69 0.12 薏苡仁 1.15 315.41 8.46 40.35 0.06 0.06 Cr 是人体的必需微量元素，具有在糖脂代谢中协助或增强胰岛素的作用，在人体中大多是生物活性很高的三价铬。1985年 Anderson 等人对健康的成年人的膳食进行了调查，发现90%的人饮食中的 Cr摄入量低于 50 ug.d。其中女性平均每天摄入25ug.di，男性 33ug.d1， 均低于美国国家食品营养委员会给出的估计的安全适宜的饮食推荐量(ESADDI)50~200 ug·d-1[6]。由此推测正常人也要注意补充适量的 Cr元素，药膳即可以其养身防病为主、发挥其持续长效为特色。在本实验所选的13种样品中，除川贝母外 Cr 元素含量均在0.23~11.82ug·gl，其中生地黄为6.72ug·g，熟地为11.82ug·g，这两种中药的 Cr 含量较高，可能与其降血糖功能有一定相关性，可为人们调整自身 Cr 元素摄入量提供依据。 微量元素Mn 在党参、生地黄、熟地黄、薏苡仁、太子参和桑叶中含量丰富，分别为151.40，174.90，239.67，315.41，555.07，564.30 ug·g。可影响胰岛素的合成与分泌，调节机体的血糖水平；亦可作为葡萄糖激酶的激活剂，并影响与糖异生有关的 丙酮酸羧化酶，直接影响血糖水平。通过检测糖尿病患者体内的 Mn 含量变化，适当补充若干以桑叶、太子参等中药配制的药膳，无疑将可以起到辅助药物治疗的功效。 Zn与胰岛素的合成、分泌、贮存、生物活性等有关。缺 Zn 可能导致胰岛素稳定性下降，诱发糖尿病。Zn 也是许多葡萄糖代谢酶的组成部分，直接参与糖的氧化供能途径。Cu 与糖尿病的发生发展有关，对胰岛素和血糖平衡起一定作用 [1，7]。Cu 和 Zn 是一对相互拮抗的元素，人体内的 Zn 和 Cu存在一定的比例，过量的 Zn 抑制机体对 Cu 的吸收利用，导致血浆铜量及铜-锌超氧化物歧化歧活性下降， Zn/Cu比大于10时就会出现这种损害。实验中所测13种药膳治疗糖尿病常用中药的 Zn/Cu 列于表2。由表3可知，所测样品的 Zn/Cu 比值大多≤7.85。且有8种样品(麦冬、葛根、党参、黄芪、生地黄、熟地黄、太子参和天花粉)的Zn/Cu 在2.00以下，符合人体的需要。例外的是知母，其 Zn/Cu 比为 14.84，配制药膳时应加以注意。另一方面，研究表明，糖尿病患者的 Cu/Zn 比值明显高于正常值(1.04)[8]。所测13种样品的 Cu/Zn 除麦冬以外都在0.07~0.97， 其中知母的 Cu/Zn 为 0.07，川贝母为0.13，薏苡仁为0.21，山楂为0.37，桑叶为 0.39，均明显低于正常值。另外，知母、川贝母和薏苡仁3种样品的 Cu/Zn 也低于一些植物性降血糖中药(例如，消渴丸的 Cu/Zn 为 0.25)。说明这些糖尿病药膳治疗常用中药对于降低糖尿病患者的 Cu/Zn 有一定作用。麦麦的 Cu/Zn 比为 2.00，高于正常值，使用该中药时须慎重。 样品 Zn/Cu Cu/Zn 样品 Zn/Cu Cu/Zn 川贝母 7.85 0.13 山楂 2.72 0.37 知母 14.84 0.07 生地黄 1.38 0.73 麦冬 0.50 2.00 熟地黄 1.21 0.83 党参 1.74 0.57 太子参 1.35 0.74 葛根 1.09 0.92 天花粉 1.03 0.97 黄芪 1.81 0.55 薏苡仁 4.77 0.21 桑叶 2.56 0.39 Se在机体内主要作为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的构成成分而发挥其抗氧化作用，并具有一定的调节血糖作用，其机制可能是 Se 具有类胰岛素的作用，能促进脂肪细胞膜上葡萄糖载体的转运过程。在本实验条件下，川贝母、党参、黄芪、桑叶、太子参和天花粉6种样品中未能检测到 Se 元素的存在。其余7种中药的Se 含量较低，在0~0.4ug·gl，其中葛根、山楂、薏苡仁含量最少，仅为0.02，0.05，0.06ug·g。 ( 在13种样品中V元素含量也较低。除熟地黄外，均 在 0.05~2.84 ug·g。熟地黄的V含量为 12.04 ug ·g，明显高于生地的V含量2.84pg·g。这种差异可能与其加工方式有关。近年的研究发现，V具有胰岛素样作用， 。 1 可促使细胞摄取糖类，加速糖的氧化，且这种作用不依赖于体内胰岛素的分泌必。从V元素含量来看，生地黄、熟地黄和桑叶(1.45ug·gl)三者相对较高，可能被用于糖尿病治疗，尤其对胰岛素抵抗性的糖尿病人具有重要意义。 ) 实验采用微波消解 /ICP-MS 测定了13种药膳治疗糖尿病常用中药的 Cr， Mn， Cu， Zn， Se 和V6种 可调节血糖的微量元素含量，所得数据准确可靠。根据测定结果分析，生地黄、熟地黄、桑叶、太子参等的6种微量元素含量较高；所选中药的 Zn/Cu(≤7.85)和Cu/Zn (≤0.97)大多在适于治疗的范围。上述结果为川贝母等用于糖尿病药膳治疗提供了实验依据，对于从微量元素的角度，研究和开发具有降血糖功能的中草药剂也具有参考价值。当然，这也只能从一个侧面反映单味中药的微量元素含量与其降血糖功能的可能关系。同时，分析测得的中药微量元素量并不能等同于人体所能吸收的量，而且药膳治疗常常涉及中药和食物等多种原料，这些物质之间又可能相互影响，要全面了解微量元素与治疗糖尿病功效的关系尚待更深入的研究。 1. 陈璐璐，微量元素与糖尿病[J].中国临床营养杂志，2002，10(3)：220. 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Shelton， CT 4ERALP 珀金埃尔默授权代理商 简介 植物是重要的食品营养来源，但 中摄取而来。因此，测定植物材料中的营养元素和有毒元素含量十分重要。 植物中的元素分析存在很多挑战。首先，为提高生产效率通常要求同时测定有毒元素和营养元素，因而需要较大的动态范围；而植物是复杂的生物实体，需要样品制备后才能实施检测。通常是先经过样品均质化，然后再消解，从而分解复杂基质并提取元素。植物样品尽管经过上述步骤的处理，但在ICP-MS检测中仍会存在基质诱导光谱干扰，会导致数据偏差甚至错误，尤其是对于含量较低的有毒元素而言。因此，采用碰撞/反应池技术可以更好地消除干扰。 从中也可发现有毒元素，主要在 其生长过程中从土壤、水和肥料 目前大麻的种植和使用在美国引起广泛关注。多个州宣布大麻合法化，可通过吸食和食品摄入两种形式满足娱乐和医药用途。因此，对其有毒和矿物元素含量的关注日渐增多。 在美国，大麻分析的另一项挑战在于合法取得样品，毕竟大麻在某些州尚未合法。不过，由于啤酒花具有类似的化学和物理特性，所以啤酒花是普遍接受的大麻替代品。 本文讨论了采用 ICP-MS 分析作为大麻替代品的啤酒花中的有毒元素和营养元素。 实验 样品制备 从某商店购得啤酒花并切碎，使之均匀且表面积增加以提高消解效率。使用配备标准75 mL PTFE(聚四氟乙烯)消解罐的 Titan MPSTM微波样品制备系统，按照表1中的消解程序进行消解。每个消解罐均含有0.25g植物材料样品、5.0mL 浓硝酸、5.0mL去离子水及 3.0mL30%过氧化氢。消解结束后，用去离子水将样品稀释至50 mL， 同时加入金(Au)以稳定汞(最终溶液中含有200ug/LAu)。 表 1. Titan MPS 微波消解程序 步骤 目标温度 (℃) 最大压力 (bar) 升温时间 (min) 保持时间 (min) 效能 1 150 30 5 5 60 2 200 30 5 20 90 3 50 30 1 10 0 仪器条件 所有分析均在配备标准进样组件组珀金埃尔默 NexlON@ICP-MS 上进行。 测定元素和所用分析模式如表2所示。通过混合三通在线添加内标。仪器进样的最终浓度为10mg/LSc、5mg/L Ge 以及 0.1 mg/L Rh、In、Tb、10%甲醇和1%硝酸。通过标准和碰撞模式相结合，每个样品的分析时间仅为100秒。 表3显示了两次啤酒花样品消解的平均结果。为了检验准确度，针对含量小于 50mg/kg 的元素进行消解前加标。所有元素的加标浓度均为20mg/L， Hg 的加标农度则为2 mg/L。所有加标回收率均在添加量的 15%以内，进一步确证了该方法的准确度良好。 表2.元素和分析模式 表3.啤酒花分析结果 ( 参考文献 ) 1. Bosnak， C.， Pruszkowski， E.， “The Determination of Toxic，Essential， and Nutritional Elements in Food Matrices Using theNex/ON 300/350 ICP-MS"， PerkinElmer Application Note. 此项工作证明， NexlON ICP-MS 结合 Titan MPS 微波系统能够有效地分析可作为大麻替代品得啤酒花中的营养元素和有毒元素。分析采用碰撞和标准模式，完成每个样品分析仅需100秒。通过分析各种 NISTTM标准植物材料验证了所应用方法的准确度。 所用耗材 组件 说明 部件编号 进样管 0.38 mm id (green/orange)， PVC， flared， 2-stop N0777042 排水管 1.30 mm id (gray， gray)， Santoprene， 2-stop N0777444 内标添加三通 在线添加内标用三通 N0777295 内标进样管 0.25 mm id (red/orange)， PVC， flared， 2-stop N0773111 多元素标液 100 mg/L Ag， Al， As， Ba， Ve， Ca， Cd， Co， Cr， Cu， Fe， K， Mg， Mn， Mo， Na， Ni， Pb， Sb，Se， Sn， Sr， Tl，V， Zn N9301721 (125 mL) 多元素盐溶液 1000 mg/L Ca， Mg， Na， K N9307805(125mL) 汞溶液 10 mg/L Hg N9300253 (125 mL) 内标液 Sc (100 mg/L)， Ge (50 mg/L)， and In， Rh， Tb (1 mg/L) N9308592 (125mL) 纯级 Au 标准品 1000 mg/L N9303728(125mL) 自动取样管 Conical， metal-free， sterile N0776118 (15mL)N0776116(50 mL) Kirsten Blake， 销售总监 Emerald Scientific 805.235.5353 www.emeraldscientific.com 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张长高科技技区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999www.perkinelmer.com.cn 要获取我们位于全球的各个分公司的完整列表，请访问www.perkinelmer.com/ContactUs ( 版权◎2015-2018，珀金埃尔默公司。版权所有。PerkinElmer° 是 PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其他所有商标均为其各自所有者的财产。 ) 应 用 说 明 ICP-Mass Spectrometry 作者： Aaron Hineman Ryan Purcell-Joiner Toby Astill PerkinElmer，Inc. Shelton CTAnresco LaboratoriesSan Francisco， CA 为了进一步验证该方法在大麻中有害金属检测中的性能，本研究针对重金属进行了 Emerald能力验证(PT)。Emerald TestM是适用于大麻检测的实验室室间比对(ILC)和能力验证程序。样品实验室间能力验证结果合格，表明该方法符合实验室间重现性和准确性的要求。该方法获授 Emerald Test Badge，如右图所示。 简介 https：//pt.emeraldscientific.com/ 由于重金属具有毒性，测定大麻花和其它大麻衍生物愈显重要，从而在北美地区使用大麻变得日益普遍的同时保证患者和消费者的安全。这种迫切形势不断转化成一种需求：测定大麻花和其他大麻衍生物中的有毒元素，如重金属镉(Cd)、铅(Pb)、砷(As)和汞(Hg)。类似于美国的联邦药物和营养保健品规定1-5，加利福尼亚6、俄勒冈和科罗拉多等州发布了大麻中重金属的的偏限度。 大麻合法化的各州区都发布了大麻和相关制品的最大允许重金属含量。其中许多限度基于 USP<232>/ICH Q3D建议。根据给药途径，限度会有所不同，这与 ICH Q3D 建议中的规定类似。目前，加拿大尚未制定有关大麻制品中金属的法规，但以 USP <232> 和 <233>作为参照指南。表1中列出了一些目前已知的重金属限度。在本研究中采用了加利福尼亚州的“所有吸食性大麻制品”限度，因为其最为严格，且最适用于大麻花。 加拿大(根据USP<232>) 加利福尼亚州 科罗拉多州 康涅狄格州1、、马里兰州、内华达州、新墨西哥州 马萨诸塞州 明尼苏达州 华盛顿州 重金属 吸食性大麻制品 (pg/g) 所有吸食性重金属大麻(ug/g) 其它大麻制品(pg/g) 花、浓缩液和输液(ppm) 每天服用量(ug)与体重(kg)比值 所有用途 (ug/kg) 仅摄入(ug/kg) 最终产品中浓度(ppm) ug/日剂量 (5g) 镉(Cd) 0.2 0.2 0.5 0.4 0.09 200 500 0.3 4.1 铅(Pb) 0.5 0.5 0.5 1 0.29 500 1000 1.0 6.0 砷(As) 0.2 0.2 1.5 0.4 0.14 200 1500 1.5 10.0 汞(Hg) 0.1 0.1 3 0.2 0.29 100 1500 0.5 2.0 大麻中的元素分析面对的挑战日益增多。主要的考虑是所需的样品制备和消解。鉴于大麻样品种类丰富多样(花、浓缩物、可食物、提取物、酊剂、蜡和油等)，必须采用有效的样品制备方案。样品制备通常先经过均匀分配，然后再微波消解，从而分解复杂基质并提取重金属。因此，本研究开发并利用特定的样品制备方案、微波消解条件和 ICP-MS 分析方法，提供适用于所有大麻样品种类的稳健方法。 ICP-MS是一种非常有效的痕量金属分析技术。由于此方法能够在复杂基质中检测到较低浓度的元素，因而成为测定大麻样品中痕量金属，特别对于某些 sub-ppb 浓度级别的金属元素来说是一种理想的检测工具。 本文通过数据表明，能够根据 USP 通则 <233>所列验证方案，使用 Titan MPSTM微波消解系统和 NexIONICP-MS 测定的大麻花中的重金属。 实验 样品制备程序 在本文工作中，所有样品都使用配备标准75 mL PTFE(聚四氟乙烯)消解罐的 Titan MPSTM (PerkinElmer Inc.，Shelton，Connecticut， USA) 微波样品制备系统进行消解。 将大约3-5g的大麻花样品粉碎并拌匀。按照加利福尼亚州的法规要求“实验室应至少分析0.5g大麻制品或大麻产品的代表性样品，才能确定是否存在重金属”，每份样品称量0.50±0.05g，移入消解罐，力入7mL硝酸(70%， v/v) 和3mL过氧化氢(30%，v/v)。 敞口罐体10分钟，以保证预反应的安全进行，随后封盖， 按照表2中的程序进行消解。为评估样品制备对分析物回收率的影响，在加入试剂前对微波罐体进行加标。为保持汞稳定，每份样品加入200 ppb金(Au)。 消解结束后，将所有样品用去离子水稀释定容至50mL。这样总稀释系数达达100倍，试剂基质为 14%HNOs。以相同的基质制备校准标准品。图1显示了大麻花和消解和分析制备后得到的清液。 表2.用于大麻样品溶解的 Titan MPS 系统微波消解程序。 步骤 目标温度 最大压力 升温时间 保持时间 效能 (℃) (bar) (min) (min) 1 160 30 5 5 90 2 200 30 5 20 100 3 50 30 1 30 0 图1.消解前后的大麻花样品 分析使用珀金埃尔默 NexION ICP-MS， 包括专有技术 Universal Cell TechnologyM(UCT)和AllMatrix Solution(AMS) 系统。NexlON ICP-MS 配置了标准的 SMARTintroM进样模块，该模块由MEINHARD玻璃同心雾化器、玻璃旋流雾室和配备2mm 内径中心管的石英炬管组成。 仪器操作参数见表3。为降低等离子体中的基质负载，并为高样品基质提供稳健的等离子体条件，将AMS 稀释系数设定为3倍，所有分析物均在碰撞模式下利用氦获得。通过上述简单的方法， UCT 利用动能识别(KED)减少或消除所有常见的多原子干扰。 校准 为了涵盖各种浓度的包括浓缩物和提取物在内的各类大麻样品，利用一个空白溶液和四个校准标准品进行校准。元素、质量数和标准浓度见表4。如前文所述，以14%硝酸制备校准空白溶液和标准品，与样品基质匹配。 为了稳定汞，校准空白溶液和每份标准品加入200ppb 金(Au)。为监测各个样品的仪器响应，在线添加内标 (Ge、In 和Tb)。 结果与讨论 方法验证 USP总则<233>定义了方法验证的要求： 准确性：待研究基质和材料必须加入目标元素，其浓度为每日最大允许暴露量(PDE)的 50%、100%和150%。每种目标元素的平均加标回收率必须介于实际浓度的70%~150%之内。 为了计算适当的加标浓度，我们采用了加州有关吸食性大麻制品吸食限度的规定，按照 50%、100%和150%加标浓度进行计算以标称制备系数100为 参数 数值 射频功率(W) 1600 雾化气流速(L/min) 0.88 稀释气体流速(L/min) 0.11 样品提取速率(mL/min) 0.20 碰撞(He)气体流速(mL/min) 4 表4.元素和标准浓度。 分析物 质量数 标准品1(ug/L) 标准品2(ug/L) 标准品3(ug/L) 标准品4(ug/L) 镉(Cd) 110.90 0.5 1 5 10 铅(Pb) 207.98 1.25 2.5 12.5 25 砷(As) 74.92 0.5 5 10 汞(Hg) 201.97 0.1 0.2 1 2 表5.每日允许暴露量和加标浓度。 分析物 吸食性产品 加标示度(ug/L) 的每日允许 暴露量 50%每日 100%每日 150%每日 允许暴露量 允许暴露量 允许暴露量 镉(Cd) 0.2 1.00 2.00 3.00 铅(Pb) 0.5 2.50 5.00 7.50 砷(As) 0.2 1.00 2.00 3.00 汞(Hg) 0.1 0.50 1.00 1.50 基准。本研究使用的限度和加标浓度见表5。 重复性：待测材料的六个独立样品必须按定义和分析的目标限度的100%加标。每个目标元素的测量值相对标准偏差(%RSD) 不得超过 20%。 耐用性：通过在不同日期，或用不同仪器或由不同分析师分析六种重复性试验溶液，执行重复性测定检验程序。每个目标元素的12个重复样品的%RSD必须小于25%。 样品分析 所有定量样品的测量数据均低于最低校准标准，即而低于可吸食大麻产品中重金属的目标限度。 表6.样品结果。 元素 样品结果 单位(ug/g) 级：合格/不合格 平均值 标准偏差 限度 1 2 3 镉(Cd) 0.029 0.037 0.042 0.036 0.006 0.2 等级：合格 铅 (Pb) 0.009 0.021 0.010 0.013 0.007 0.5 级：合格 砷(As) 0.027 0.030 0.045 0.034 0.010 0.2 合格 汞(Hg) 0.056 0.044 0.044 0.048 0.007 0.1 等级：合格 符合验证标准 所有定量样品的测量数据均低于最低校准标准，即低于可吸食大麻产品中重金属的目标限度。 准确性 本方法的准确性数据列于表7。其中，表明样品基质中的预消解加标回收试验在所有三个加标浓度(目标限度的50%、100%和150%))下全部合格，且每个目标元素的平均加标回收率在 70-150%接受标准范围内。 重复性 消解六个独立制备的大麻花样品，然后按目标限度的100%加标并进行分析，结果如表8所示。所有 目标元素的 %RSD 均在3%以内，远优于20%的接受限度。 耐用性 表7所示重复性研究所用的六个样品由两个不同的分析师制备。12个测定值的 %RSD 均小于2.5%(如表9所示)，远优于25%的方法要求。 表7.准确性试验结果。 元素 未加标样品 平均浓度 平均回收率 (%) 合格/ (ug/g) 50% 100% 150% 不合格 镉(Cd) 0.036 87 94% 91 合格 铅(Pb) 0.013 81 85% 84 ：合格 砷(As) 0.034 94 96% 98 合合格 汞(Hg) 0.005 97 95% 107 合格 元素 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 平均值 %RSD 合格/ (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (pg/g) (ug/g) (ug/g) 不合格 镉(Cd) 0.22 0.21 0.23 0.22 0.23 0.23 0.23 2.90 合格 铅(Pb) 0.22 0.21 0.23 0.22 0.23 0.23 0.23 2.90 合格 砷(As) 0.43 0.43 0.44 0.43 0.45 0.47 0.44 1.10 合格 汞(Hg) 0.23 0.22 0.22 0.23 0.24 0.24 0.23 1.10 合格 表9.耐用性试验结果。 元素 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品 10 样品11 样品12 平均值 %RSD (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) 镉 (Cd) 0.22 0.21 0.23 0.22 0.23 0.23 0.20 0.21 0.19 0.21 0.19 0.21 0.21 7.07% 铅 (Pb) 0.43 0.43 0.44 0.43 0.45 0.47 0.38 0.43 0.38 0.42 0.38 0.43 0.42 6.85% 砷(As) 0.23 0.22 0.22 0.23 0.24 0.24 0.20 0.22 0.21 0.22 0.21 0.22 0.22 5.26% 汞(Hg) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.11 0.09 0.10 0.09 0.11 0.09 0.10 0.10 4.96% ( 此项工作证明，珀金埃尔珀 NexION ICP-MS 结合 Titan MPS 微波消解样品制备系统能够对大麻花样品进行准确、可靠地分析，所有定量样品数据均低于“吸食性大麻制品”中重金属的目标限度。此项工作全面符合 USP总则<233>中所述检验方案的接受标准。 ) ( 参考文献 ) ( 1. United States Pharmacopeia (USP) and The Na t ional Fo r mulary (NF) Onl i ne (USP-NF)： h ttp：//w w w.usp.o r g/usp-nf/ke y -issu e s / elem e nt a l - imp u riti es ； ) ( 2. ICH ( International Conference on H a rmonization of Technical Requirements f o r Registration o f P harmaceuticals for HumanUse) Q3D Step 4- G u ideline for Elemental Impurities；_ h t tp ：//www.i c h .or g/fi l ead mi n /Publ ic W eb Si t e/ IC H P r o d u cts/ G u i d el in e s /Q ualit y/Q 3 D/ Q 3D _ Ste p 4 .pdf ； ) ( 3. United States Pharmacopeia General Chapter <232>Elemental Impurities i n P harmaceutical Materials - Limits：Second S upplement to U SP 39-NF 34， M ay， 2016， U pdatesPublished in Pharmacopeial Forum 42(2)； ) ( 4. United States Pharmacopeia General C hapter <233>Elemental I mpurities in Pharmaceutical M aterials - Procedures：Second Supplement to USP 3 8-NF 33， December， 2 015； ) ( 5. 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Ruppel Nathaniel KuffelPerkinElmer， Inc.Shelton，CT 在美国一些州合法的分析大麻被重新重视起来。大麻属包括几个不同种类如大麻类。主要感兴趣的成份有四氢大麻酚(THC)、大麻二酚 (CBD)和大麻酚 (CBN)。大麻属 最主要的分析在于定性、定量分析四氢大麻酚和大麻二酚及其比例。分析大麻用于不同的目的。这篇应用文献的主要讲述采用气相色谱法对大麻中四氢大麻酚和大麻二酚进行定性、定量分析。其它应用文献包括高效液相色谱的潜力、杀虫剂及残留溶剂分析。 到2014年，大麻在美国20个州和哥伦比亚特区合法化。联邦法规定拥有大麻为非法。这可能影响大麻产品的洲际运输，但它也能影响实验室拥有用于测试目的的大麻。需要咨询国家监管机构取得适当的许可要求。 对于消遣用大麻产品，影响心理状态的主要成份是四氢大麻酚。理想的消遣用大麻的包括高含量的四氢大麻酚和低含量的大麻二酚和大麻酚。这些信息可被用来比较哪些植物材料中四氢大麻酚的含量。含有高含量四氢大麻酚的植物材料具有更高的价格。这些信息对种植者、药厂和税务当局有价值。 医用大麻产品，通常表现在高含量的大麻二酚和低含量的四氢大麻酚。治疗用的大麻二酚具有令人满意的药效但是作用于精神的四氢大麻酚对一些病人是多余的。四氢大麻酚/大麻二酚的比例信息对于医务人员开具医用处方尤为重要。医用大麻的效果包括减少症状，如恶心、癫痫、眼压升高和疼痛。 大麻的管理和消费存在不同形式。植物可用来吸烟、或者直接添加至烘培食品中。萃取的大麻能被用来包括像黄油一样用于烹饪、烘焙或作为液体酊用于石油产品的直接摄取。食用和酊剂和吸烟相比可以提供更持久的效果。 复合分析通常包括： *宏观和微观分析 *效能测试：四氢大麻酚/大麻二酚比例 *安全性：霉菌、霉、微生物、细菌，农药残留，萜类，黄酮类，萃取浓缩液的溶剂残留，重金属 在大麻植物材料中已确定有超过40种大麻类物质。大部分浓度均为微量水平，但八个主要感兴趣的大麻类必须进行效能测试。 大麻色原烯(CBC) 大麻二酚(CBD) 主要治疗成分 △8-四氢大麻酚(△8THC)A9-四氢大麻酚 主要影响精神成份(△9THC)大麻萜酚(CBG)大麻酚(CBN) 样品分解由于时间及贮藏条件四氢大麻酚酸(THCA) 四氢大麻酚在植物材料中存在(羧基 THC) 形式，GC未检测 大麻二酚酸(CBDA) 四氢大麻酚在植物材料中存在 (羧基 CBD) 形式， GC未检测 主要的大麻素在大麻植物中是以四氢大麻酚酸存在，其性质不稳定，在吸烟、烹饪及高温GC进样口中通过去碳酸基反应转换为四氢大麻酚。由于这个原因，四氢大麻酚酸不是采用气相色谱法，而是由高效液相色谱法检测。 对于部分病人，四氢大麻酚酸有令人满意的治疗效果。因此，通过一些条件可以确保四氢大麻酚酸不会转变为影响精神的四氢大麻酚。可食用的形态、酊剂、油剂能有效的保存四氢大麻酚酸。 药用大麻通常有更高的大麻二酚和更低的四氢大麻酚。如：21%的大麻二酚、1%的四氢大麻酚。 娱乐性大麻通常有更高的四氢大麻酚和更低的大麻二酚。如：24%的四氢大麻酚、2%大麻二酚。 现代大麻四氢大麻酚的含量比1970年的大麻高出4-6%。 一般来说，可使用的部分、提取的液体和固体是不需要检测农药、霉菌、霉病，但是如果植物材料用于萃取则必须检测。但这些提取物还必须测试四氢大麻酚和大麻二酚的含量。从食物基质中提出需要付出更大的努力。 分析方法：气相色谱 or 液相色谱 两个方法都已经成功用于大麻的含量测定：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)。每个方法都有优缺点。 参考了各个州的检测法规中建议的分析技术。 *大麻功效检测中最重要的是总四氢大麻酚含量，因为四氢大麻酚/大麻二酚的比例决定治疗价值。 *总的四氢大麻酚=四氢大麻酚+四氢大麻酚酸 *总的大麻二酚=大麻二酚+大麻二酚酸 (每种物质都要对羧酸根进行质量校正). 高效液相色谱法可以检测转换为自由形态的四氢大麻酚和大麻二酚之前的四氢大麻酚酸和大麻二酚酸。通常用于可食用的材料和提取的药酊。这个方法也可以用于植物含量检测和大麻素的比例分析。 气相色谱不能直接检测四氢大麻酚和大麻二酚酸，在吸烟、烘烤、气相进样口中会发生去羧基反应。四氢大麻酚酸和大麻二酚酸去除羧基后转变为四氢大麻酚和大麻二酚。 在气相色谱进样口中，羧基会发生原位脱羧反应生成自由形态的大麻素，但这种转换不完全取决于温度和进样口的影响。加热样品后在用GC分析样品，可以得到具有更高转换效率的精确的结果报告。气相色谱模拟植物材料在吸烟过程中的转化过程。GC比高效液相色谱更更、更简单、所以通常是首选。GC/FID对大麻素进行定性定量分析，通常具有更快的、更简单的分析速度。为了更好的识别每种大麻素，气相色谱质谱联用仪将是首选。通用的GCMS系统应该包含两个进样口和一个FID检测器。GCMS通道可以使用小口径的毛细管柱，以提高分辨率和减少柱流失。质谱也能用来分析萜类大麻素和杀虫剂。 采用气相色谱法，大麻的效能测试是基于脱羧后四氢大麻酚和大麻二酚的浓度。 采用高效液相色谱法，大麻的效能测试是基于四氢大麻酚和四氢大麻酚酸之和。 实验/分析： 在THC/CBD分析中，需要采用有机溶剂溶解植物材料中多叶大麻表面的油性树脂。已经成功应用的溶剂包括甲醇、异丙醇、乙酸乙酯等。提取的上层清液注入气相色谱仪进行分离采用FID或者质谱仪检测。 样品处理： 为了确保样本的同意，按照法规规定随机抽取植物叶、芽、花等有效部分。在35℃强制通风环境干燥样品2小时，称样100mg干燥样品，研磨后的样品需要通过1mm的筛网，加入30ml有机溶剂，超声30min，过滤(增加步骤可使THCA转换为THC)：在200℃蒸干20min，有机溶剂定容，气相色谱检测。 气相色谱柱的选择： 几种类型的色谱柱都可以用于大麻类的分离，通常采用小孔径、薄膜涂层非极性色谱柱。非极性色谱柱如100%二甲基聚硅氧烷和5%苯基95%二甲基聚硅氧烷由于没有足够的极性使大麻二酚与大麻色原烯分开。这对于精确测定THC/CBD尤为重要。一个中极性色谱柱很好的解决了重要大麻类物质的分离。35%苯基65%甲基硅油色谱柱可以保证这些成份的分离，同时仍然具有很高的温度限制，允许所有大麻类物质洗脱出色谱柱。 采用GC/FID9分钟运行时间的气相色谱条件。 色谱柱： Elite-35 15m*0.53mm*0.5um 载气：4ml/min 氢气 进样口：毛细管分流进样口，装填玻璃棉的分流衬管，275℃ 检测器： FID 采用GCMS30分钟运行时间的气相色谱条件：包括萜类和杀虫剂(不分流) 色谱柱： Elite-35 30m*0.25mm*0.25um 载气：1.3ml/min 氦气 进样口：毛细管分流进样口，装填玻璃棉的分流衬管，275℃检测器：质谱检测器，质量范围：50-400 da 采用小孔径色谱柱，大麻素可以在3min内完成分离。但现实样品中有大量的△9THC能使小容量色谱柱过载。因此选择0.53mm直径的色谱柱，因为其有更大的样品容量。真实样品中有几种较晚流出的大麻类物质，因此需要保持足够的时间和温度，使大麻酚之后的六种痕量大麻素流出后，才能进行下一个样品分析。因此， 3min的色谱分析是不现实的，9min的GC/FID方法更为实际。 ( 分析标准： ) 商业标示品是典型的1000ug/ml的浓度。另一种标准品是三种大麻类(CBD、A9-THC、CBN)的混标，每种1000ug/ml。市场上没有特定比例 (THC/CBD)的标准品。一个合适的浓度可以从商业标准品配置得到。 ( 典型的样品制备方法，称取100mg干燥样品材料融入 30ml有机溶剂，娱乐用大麻会有一个预计为20%浓度。20mgTHC溶解在30ml溶剂中与666.7ug/ml的标准品，是同一量级的标准。如有需要，可以额外稀释样品， 使THC在线性范围内。 ) ( 其它大麻类将检测至大约1%的水平。例如：采用990ul △9-THC (1000ug/ml)+10ul三种混合物(1000ug/ ml)，可以配置成娱乐用大麻使用的合适的校准标准。 这是一个典型的高THC和低CBD的标准。类似的稀释可用于高CBD和低THC的校准标准。如有需要，可以额 外稀释样品，使THC在线性范围内。植物材料中的THC 和CBD通常以重量/重量%被报告出来。 ) 图1.大麻类的GC/FID谱图 典型测试： 涉及个别管辖规定的实际检测要求。 宏观/微观检测 色彩一致性、碎片、茎、种子、污染物和添加剂。在许多地方添加剂的加入，为了改善植物材料的外观和重量。加入肉眼可见的类似油性树脂状的细沙，以增加重量。细微的粉末导致了重量显著增加。 THC/CBD 效能 在各州的监管中，没有一种方法可以像DEA方法一样(毒品管制局)。主要分析方法为气相色谱法。报告中的THC%是相对于原始植物材料的质量百分比。 杀虫剂、杀菌剂 在各州的监管中，没有一种方法可以像EPA方法一样(环境保护局)，进行农药残留分析。通常采用固相萃取或 QuEChers提取净化，GCMS选择离子扫描分析检测。高效液相色谱法分析氨基甲酸酯杀虫剂。一些管理机构定义部分杀虫剂浓度超过0.1ppm即为检出。各个国家的规定将被修改，因为关于大麻的趋势仍将继续。 代表性的杀虫剂包括： *有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类采用GCMS检测 *氨基甲甲酯类采用HPLC或HPLC-MS 萜类化合物 大麻本身不具有味道，萜类化合物为大麻提供香味。大麻植物材料中存在几种萜类化合物，包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-石竹烯等等。通常采用GCMS分析检测。 霉/霉菌/微生物/真菌/细菌 微观检测培养皿培养曲霉菌、大肠杆菌和沙门氏菌。 重金属 萃取之后的大麻溶液按配方制成大麻油、蜡、黄油(芽)和其他形式。用于提取的溶剂有几种类型，如二氧化碳、丁烷、丙烷、乙醇、异丙醇、丙酮等。为了安全起见，在消费前，必须从最终产品中除去溶剂。残留溶剂通过顶空气相色谱法氢火焰离子化检测器(HS-GC-FID)检测。各州的监管中没有特定的方法，植物制剂中有机溶剂残留遵循国际协调委员会的指导标准。 各州的监管中没有特定的方法，重金属检测遵循美国食品和药品管理局的指导标准。通过ICPMS分析痕量污染物，例如铅、汞、砷、镉、铬等等。 图2大麻类物质GCMS色谱图 图3四氢大麻酚EI-质谱图 图4大麻类和杀虫剂流出时间 结论 GC/FID可以快速测定大麻中THC和CBD浓度用于评定用于娱乐性质或者药用性质的植物材料。GCMS可以快速的识别阳性大麻样品。GCMS可以用于大麻的附加安全测试。 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：// www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs 版权所有 ◎2014， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@ 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 011841B_CHN_01 应 用 说 明液相色谱法/质谱法 作者 Avinash Dalmia'， Erasmus Cudjoe'， Toby Astill，Jacob Jalali ， Feng Qin²， Molly Murphy ， Travis Ruthenberg’ PerkinElmer， Inc.，Shelton， CT "PerkinElmer， Inc.，Woodbridge，ON， Canada PerkinElmer， Inc.，San Jose， CA SC Labs，Tigard， OR SSC Labs.Santa Cruz， CA 满足农药残留和真菌毒素监管要求的工业大麻液质联用分析方法 简介 由于大麻对癌症、多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症(ALS)等疾病具有治疗效果，美国超过半数的地 区已经将医用大麻的使用合法化。1.3与传统的农作物一样，农药有时也用于大麻种植中，以保护大麻免受虫害，并提高产量。长期接触农药会引起严重的健康风险；因此，大麻中的农药分析对于消费者的安全来说是一个重要的话题。近来，新闻报道称，受农药残留高度污染的大麻产品比例惊人，导致大麻产品召回，并引发公共安全警报。现已发现，大麻花上残留有禁用的农药，如，腈菌唑、吡虫啉、阿维菌素、乙螨唑和螺虫酯，这些农药残留物在大麻提取物和大麻食用品中得到了进一步的浓缩。2015年10月，由于农药污染，科罗拉多州召回了 20，000 包大麻花，2016年11月，俄勒冈州官方针对特定批次的大麻发布了健康警报。而且，现今的许多大麻产品都是通过燃烧吸入，因此，消费者和监管机构越来越担心吸入农药化合物的未知影响。4-除农药外，大麻的生长条件也有利于霉菌和真菌的生长，这些霉菌和真菌会产生致癌的真菌毒素，包括赭曲霉素A和黄曲霉毒素。因此，对大麻中农药和真菌毒素的检测对于确保消费者安全和质量控制来说至关重要。 高效液相色谱-串联质谱法； (LC-MS/MS) 已成为农药和真菌毒素分析的首选方法，因为它具有优越的选择性、灵敏度、重现性，而且在分析前无需繁杂的样品前处理。尽管已有气相色谱-质谱法(GC-MS/MS)可用于大麻样本中的农药分析，但此类方法只适用于一小部分分析物。诸如丁酰(极性较大化合物)以及阿维菌素t((高分子量化合物)之类的化合物，不适合用 GC-MS/MS 法进行分析，因为这些化合物在 GC 的进样口位置或者高温的色谱柱中遇热不稳定且易分解。对于复杂基质中的农药分析， GC-MS/MS 方法不像LC-MS/MS 方法那样适用，因为 GC-MS/MS 方法需要繁杂的样品前处理，以防止复杂的基质污染 GC 的进样口。6，7 由于对于大麻样本的农残分析没有联邦指南，美国各州已经制定了各自的测试指南。俄勒冈州是美国第一个对大麻中农药残留分析制定综合指南，并为大麻中59种农药设定监管限值的州。然而，加州已经对大麻花和大麻食用品中的66种农药(包括俄勒冈州名单上除一种农药以外的所有其他农药，以及另外8种农药)和5种真菌毒素的残留物制定了更严格的残留限值。。目前已有大量关于大麻农药分析的报告发表，但这些研究有一定的缺陷。10-12大多数此类研究要么没有达到加利福尼亚州的残留限值；要么使用耗时的样品前处理方法(例如， dSPE 的 QuEChERS 方法)且对某些农药的回收率较低，需要使用基于 LC-MS/MS 和GC-MS/MS的仪器来分析所有的农药。这大大增加了分析的成本、复杂性和分析时间。在本项研究中，珀金埃尔默(PerkinElmer) 应用开发团队分析了添加在大麻花提取物中的所有66种农药(包括典型的用 GC-MS/MS 方法分析的极度疏水性农药和含氯农药)和五种真菌毒素，其分析结果远远低于加加福尼亚州规定的残留限值。LC-MS/MS 仪器使用电喷雾离子源(ESI) 和大气压化学电离源!(APCI)以及采用简单的溶剂提取方法，该方法对所有分析物的回收率都达到了 70%-120%的可接受范围。 实验 硬件/软件 采用珀金埃尔默 LC-MS/MS QSight@ LX50 UHPLC 系统进行色谱分离，同时利用具有双离子源，即电喷雾离子源(ESI)和大气压化学电离源(APCI)的珀金埃尔默 QSight 220 MS/MS 检测器进行检测，该检测器独立运行，具有两个独立的离子源入口。所有的仪器控制、数据采集和数据处理都使用 Simplicity TM 3Q 软件平台完成。 样品制备方法 下面是10倍稀释后的样品制备步骤： 取大约5g大麻花，作为每个样品批次的代表物，用研磨机研磨。 量取1g的样品，放入50mL离心管中。 添加10uL的内标溶液。 ●将3个钢球(直径10mm)加到试管中，以便提高涡旋混合时的提取效率。 加入5 mL LC/MS级的乙腈到试管中，并将其盖紧。 将试管放置在多管旋涡混合器上，涡旋混匀10分钟。 以每分钟3000转的转速离心10分钟。 用 0.22 um 的尼龙注射器将溶剂过滤到5mL的安瓶中，并将其盖紧。 将样本ID贴在瓶子上。 取 0.5 mL的提取样品转移到2mL的液相小瓶中，再用0.5 mL 的 LC/MS级乙腈稀释，并混合。 注入3uL的样本，使用农药方法进行LC-MS/MS 分析。 LC方法以及MS离子源条件 LC 方法和 MS源参数如表1所示。 LC条件 LC柱 珀金埃尔默 Quasar Pesticide Column (4.6 × 100 mm，2.7 pm) P/N： N9306880 流动相A(ESI方法) 2mM甲酸铵+0.1%甲酸(水) 流动相B(ESI方法) 2mM甲酸铵+0.1%甲酸(甲醇) 流动相梯度 单个样品运行时间为 18.5 min 的方法(包括分析时间和柱平衡时间)。采用了使用电喷雾离子源(ESI)以及具有最佳分离梯度的 LC-MS/MS方法，对具有最小基质干扰的大麻基质中66种农药中的63种以及五种真菌毒素的残留进行了较低浓度的分离和分析。一个快速的6min 方法，应用了具有短梯度、最佳流动相组成和 APCI源的LC-MS/MS方法，对剩余三种农药进行了分析。 柱温箱温度 30℃ 自动进样器温度 10℃ 进样体积 3.0pL，用于采用 ESI 源的 LC-MS/MS 方法10pL，用于采有 APCI 源的 LC-MS/MS 方法 ESI 源和 APCI源的IMS源条件 ESI电压(正离子模式) +5500V ESI电压(负离子模式) -4200V APCI电晕放电 -5 pA 干燥气体 120(任意单位) 雾化气 350(任意单位) 离子源温度 315℃ HSID 温度 200℃ 检测模式 时间管理 MRM TM 大麻样品中检测农药残留的分析挑战 由于在本项研究中分析的农药包括极性和非极性化合物，所以使用100%的乙腈从样品中提取所有的分析物。由于大麻基质的疏水性，用含水流动相对提取物进行了进一步稀释，使其与反相柱兼容。该方法导致某些农药的回收率由于沉淀而降低。为了达到更高效的方法，用乙腈将大麻提取物稀释10倍，提高农药回收率，并减少基质影响。然而，反相LC方法在液相运行开始时使用含水流动相，以便更好地保留柱上的极性化合物。在LC上注入有机溶剂溶解的样品，比如乙腈样品，会导致极性化合物过早洗脱，而使峰型变差。为了解决这一问题，该方法采用了3微升的小体积进样量。 大麻中的农药分析是非常具有挑战性的，因为它的基质成分非常复杂，含有不同种类的化合物，如大麻素、萜类、烃类、糖、脂肪酸、黄酮类等。样品的基质影响仍然是LC-MS/MS 方法主要考虑的问题，并且基质会导致离子信号的抑制和产生基质干扰。此外，由于天然大麻类、萜烯化合物含量差异很大，大麻中农药残留的定量检测成为一项困难的任务。在该方法中，我们采用了一种稀释的通用提取方法，选择了最优的 MRM 离子对通道，并对LC梯度进行了优化，从而使得在复杂的大麻基质中对于农药的低水平分析具有良好的回收率。 通常情况下，大麻和其他食物基质中的农药分析是通过GC-MS/MS 和LC-MS/MS 方法完成的，因为某些非极性农药和含氯农药很难用电喷雾离子源进行电离。13-14 为 了演示该方法的方便性，应用团队开发了一种同时采用APCI 和 ESI 技术的 LC-MS/MS 方法，对所有农药(加利福尼亚州受管制的农药清单)进行了分析，这种方法还可提高分析能力、降低分析的复杂性以及分析成本。通常，大麻样本中发现的污染基质会导致在 GC-MS/MS 和 LC-MS/MS 系统的接口发生堆积，增加维护成本和停机时间，从而导致分析效率降低。结果表明，该项LC-MS/MS 方法对较脏的大麻基质造成的污染具有较强的免疫力。 检测能力和重现性 图1显示的是MRM色谱图，在大麻花中以0.01u g/g的低水平加入的一组代表性的农药具有极佳信噪比。表2、3和4汇总了大麻提取物中各农药(二类和一类)以及真菌毒素的定量限(LOQ)!以及在定量限水平的响应重现性。定量限 (LOQ)的测定是通过考虑定量离子和定性离子的信号(两者都是S/N>10) 并确保产物离子比率在预期比率的20%的公差范围内。如表2和表3所示，对于所有列出的二类农药和真菌毒素而言，在本研究中测定的定量限 (LOQ)远低于加利福尼亚州残留限值直2到600倍。在大麻基质中，在定量限(LOQ)水平的每一种农药和真菌毒素的响应 RSD 者低于 20%。每一种分析物的保留时间在24小时(±0.1分钟)内是可重现的。这表明，该方法对于加利福尼亚州规定的限值水平的大麻中的农药和真菌毒素分析具有足够的灵敏度和较好的重现性。 序号 二类真菌毒素 定量限 (LOQ) 限量值(ug/g) 限量值 /QSight定量极限 QSight (ug/g) %CV (n=7) 1 赭曲霉素A 0.010 18 0.020 2.0 2 黄曲霉毒素B1 0.001 18 不适用 不适用 3 黄曲霉毒素B2 0.0015 14 不适用 不适用 4 黄曲霉毒素 G1 0.010 18 不适用 不适用 5 黄曲霉毒素G2 0.0015 19 不适用 不适用 6 黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2) 0.005 NA 0.020 4.0 表4.采用 LC-MS/MS 方法分析的大麻中所含加利福尼亚州一类农药的定量限(LOQ)红色/绿色：通常采用 GC-MS/MS 方法分析的农药，红色：通过电喷雾离子源(ESI) 在 LC-MS/MS 仪器上分析的农药，绿色：通过大气压化学电离源(APCI)在LC-MS/MS仪器上分析的农药 序号 一类残留农药 限量值(ug/g) 限量值/定量限 (ug/g) %CV (n=7) 1 涕灭威 0.010 10.6 0.1 10 2 卡巴呋喃 0.010 3.1 0.1 10 3 氯丹 0.05 13.3 0.1 2 4 溴虫腈 0.05 6.0 0.1 2 5 毒死蜱 0.010 5.0 0.1 10 6 蝇毒磷 0.010 10.8 0.1 10 7 丁酰肼 0.015 14.4 0.1 6.67 8 敌敌畏(二氯松) 0.025 12.2 0.1 4 9 乐果 0.010 3.8 0.1 10 10 灭线磷 0.010 9.5 0.1 10 11 醚菊酯 0.010 5.6 0.1 10 12 苯氧威 0.010 11.3 0.1 10 13 氟虫腈 0.010 19.1 0.1 10 14 抑霉唑 0.010 23.1 0.1 10 15 灭虫威 0.010 3.8 0.1 10 16 甲基对硫磷 0.040 1.4 0.1 2.5 17 速灭磷 0.025 13.5 0.1 4 18 多效唑 0.010 12.5 0.1 10 19 残杀威 0.010 6.9 0.1 10 20 螺环菌胺 0.010 10.2 0.1 10 21 噻虫啉 0.010 9.5 0.1 10 样品基质加标 样品基质加标校准是定量分析的首选分析方法，因为它弥补了在大麻样品分析中普遍存在的基质效应问题。在基质中的化合物与分析物共洗脱的情况下，离子化过程中，分析物的离子抑制导致了响应的降低或增加。由于样品的基质效应，利用样品基质匹配的校准曲线来进行定量，该曲线是通过进样分析空白的大麻花提取物和空白的大麻花提取样品中分别加入0.1-1000ng/mL范围内不同浓度的农药和真菌毒素而生成的。所有的农药和真菌毒素的校准曲线都是线性的，其校准曲线对于所有化合物，都满足R2 大于0.99。 溶剂萃取回收研究 利用QuEChERS 萃取技术是从含水量较高的基质中(例 如水果和蔬菜)提取低含量污染物(例如农药)的常用方法。15该方法包括萃取多种农药，去除水果和蔬菜中常见的糖、有机酸和其他化合物。16-20对于同时列入加利福尼亚和其他州监管列表中极性较大的农药，该方法不适用，如丁酰肼。由于丁酰肼极性较大，不能用QuEChERS 有效地提取，仍然溶解在水相中，并且在盐析后中也不能溶解到有机相中。有报道称，利用QuEChERS 萃取技术从大基基质中萃取的丁酰肼的回收率不到10%。10此外，大麻基质通常含有大量的疏水性化合物，如大麻素和萜烯，因此， QuEChERS萃取无法在盐析过程中去除基质干扰物。不同的研究小组已经尝试开发具有 d-SPE步骤的先进QuEChERS方法，利用PSA和其他吸附剂从大麻提取物中去除基质。然而，将 d-SPE步骤加入到QuEChERS 方法不 仅使这种方法更加费时费力、更加昂贵，而且还会导致诸如多杀菌素、螺虫乙酯、螺环菌胺、赭曲霉素A和其他一些化合物的回收率较低。11-12这是由于在d-SPE步骤中，这些化合物与 PSA 吸附剂结合而导致较低回收率。由于利用QuEChERS 方法从大麻基质中萃取农药存在以上缺点，应用开发小组使用了一种简单的乙腈溶剂萃取方法。为了确定这种方法，采用了基质加标的大麻花样本，来确定农药和真菌毒素的回收率。对大麻花的样本进行了测定，以确认不含农药。在五个大麻花样本中加入了两种浓度(低和高)的所有农药(0.1和1pg/g)和真菌毒素：((0.02和0.1pg/g)的标准品。以上两种浓度是根据加味福尼亚和其他州规定的农药和真菌毒素的残留限值确定的。表5-7显示，两种不同浓度的所有66种农药和五种真菌毒素的绝对回收率在70%-120%的可接受范围内，五个大麻花样本的相对标准偏差(RSD) 低于20%。当加入量很低时，有两种农药未得出回收值，因为低于其定量限值 (LOQ)。 具有最佳MRM 的LC-MS/MS 方法用于大麻基质中具有挑战性的分析物 如上所述，大麻是一种具有挑战性的分析基质，而农药的含量很低，使得分析更加困难。为了确保最高的分析可信度，并且使基质干扰的影响降至最小，最终确定在大麻基质分析中采用MRM 方式以实现低浓度的测定。例如，灭螨醌是一种杀虫剂，在某种程度上很容易电离成分子离子，但是在大麻基质中，采用MRM 测定结果为0.5到1 pg/g的低定量限(LOQ))，高于了加利福尼亚州残留限值的五到十倍。因此，采用选择替换的MRM 设定方式，如加合离子，来减少基质的干扰，并实现大麻基质中灭螨醌0.025 pg/g(低于残留限值的四倍)的定量量(LOQ)。图2显示了空白大麻基质和大麻中加入浓度0.1 pg/g灭螨醌的MRM 通道的信号叠加。该图显示，使用最佳的灭螨醌的MRM方式进行测定，可以使基质干扰影响降至最小，有助于实现更低的检测限值。 高分子量的化合物(如阿维菌素) ，7和一些较快洗脱的极性化合物(如丁酰肼)，采用GC-MS/MS 方法很难在低浓度水平上进行测定，因为它们会在GC进样口或柱温箱的高温条件下分解。尽管高分子量化合物(如阿维菌素) ，以及极性化合物(如丁酰肼)可以采用电喷雾离子源(ESI)电离，但它们也容易在高温下分解。图3显示了阿维菌素在 HSID 和源温度作用下的反应。基于这些结果，确定了电喷雾离子源 (ESI) 和 HSID 温度的最佳温度值，以使高分子量和极性农药的信号达到最佳值。阿维菌素还容易产生钠和钾的加合离子，这是由于钠离子和钾离子从玻璃器皿中过滤到流动相中引起的。由于很难控制从玻璃器皿中滤出的钠离子和钾离子，所以对阿维菌素使用钠离子加合物作为Q1(母离子)质量数进行分析会导致响应不稳定。为了减少钠或钾的加合离子，在流动相中加入一定量的铵盐。在流动相中加入铵盐混合以及采用最佳的温度条件，可使得阿维菌素产生了良好的、重复稳定的信号。 图2.(a)大麻基质(红色)以及在大麻基质中加入浓度 0.1 ug/g灭螨醌(绿色)的 MRM 分子离子峰的响应信号叠加；和(b)大麻基质(红色)以及在大麻基质中加入浓度 0.1 ug/g灭螨醌(绿色)的 MRM加合离子响应信号叠加。 图3.在电喷雾离子源 (ESI))(a)和 HSID 温度(b)下的阿维菌素信号。 表5.采用乙腈溶剂萃取法从大麻中回收两种不同浓度的二类农药的回收率。 序号 二类真菌毒素 低浓度0.1 ug/g 高浓度1 ug/g 回收率((%) RSD%(n=5) 回收率(%) RS%(n=5) 1 黄曲霉毒素B1 75 15 84 9 2 黄曲霉毒素B2 78 14 82 9 3 黄曲霉毒素G1 76 12 85 7 4 黄曲霉毒素 G2 79 12 84 6 5 赭曲霉素A 78 20 83 7 表7.采用乙腈溶剂萃取法从大麻中回收两种不同浓度的一类农药的回收率。 低浓度0.1 ug/g 高浓度1 ug/g 序号 一类残留农药 回收率(%) RSD%(n=5) 回收率(%) RS%(n=5) 1 涕灭威 87 11 94 11 2 卡巴呋喃 86 11 91 9 3 氯丹 87 19 92 10 4 溴虫腈 95 15 99 10 5 毒死蜱 94 8 92 8 6 蝇毒磷 90 12 95 10 7 丁酰肼 82 15 80 14 8 敌敌畏(二氯松) 94 14 91 11 9 乐果 89 11 96 9 10 灭克磷(灭线磷) 92 9 94 7 11 醚菊酯 88 13 93 8 12 苯氧威 91 11 93 7 13 氟虫腈 89 9 95 8 14 抑霉唑 86 10 89 10 15 灭虫威 81 9 93 6 16 甲基对硫磷 89 14 96 11 17 速灭磷 86 10 95 10 18 多效唑 79 13 90 6 19 残杀威 91 13 93 9 20 螺环菌胺 88 9 89 9 21 噻虫啉 89 13 95 10 对农药的分析，通常采用 GC-MS/MS 和 LC-MS/MS 方法进行分析。 加利福尼亚州和其他州管制的很多农药，在大麻中传统上一般都采用具有EI源的 GC-MS/MS 方法进行分析，因为这些农药具有较低的质子亲和力，使用ESI源时电离效率比较低。对于一些通常采用 GC/MS 方法来分析的农药包括氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、克菌丹、二溴磷、氯菊酯以及除虫菊酯，为了达到所要求的灵敏度，选定的 MRM 是通过一个加热的电喷雾源进行优化的。这些分析物的定量限(LOQ) 在0.01到0.25pg/g的范围内，远低于加利福尼亚州的残留限值。 对大麻中除虫菊酯同分异构体的分析 除虫菊酯是一种有机化合物，通常由除虫菊制成，针对昆虫的神经系统，具有有效的杀虫活性。除虫菊酯是一组六个同分异构体，它们的结构如图4所示。从菊花中提取的自然生成的除虫菊酯，是菊酸的酯类(除 虫菊酯1、瓜菊酯1和茉莉菊酯Ⅰ)和除虫菊酸的酯类(除虫菊酯Ⅱ、瓜菊酯Ⅱ和茉莉菊酯Ⅱ)。在美国，除虫菊酯提取物的标准是占总除虫菊酯中的45%-55%，在市面上可以买到的除虫菊酯标准品中，除虫菊菊Ⅰ、除虫菊酯Ⅱ、瓜菊酯1、瓜菊酯Ⅱ、茉莉菊酯Ⅰ和茉莉菊酯Ⅱ的比例分别为约56.1%、27.8%、5.7%、3.8%、4%和2.6%。大麻中的许多化合物与除虫菊酯的结构相似，因此，由于基质的干扰，很难对大麻中的除虫菊酯进行分析。为了使基质的干扰降到最小，制定了最佳的 MRM 通道和LC的梯度，能够检测到大麻基质中低浓度的六种除虫菊酯。采用优化后的 MRM通道和 LC梯度设定的 LC-MS/MS方法进行分析，得出的六种除虫菊酯的定量限(LOQ)是：大麻花中除虫菊酯1、除虫菊酯Ⅱ、瓜菊酯1、瓜菊酯Ⅱ、茉莉菊酯l和茉莉菊酯Ⅱ分别为0.1、0.1、0.01、0.03、0.025以及0.01 pg/g。 图4.除虫菊酯6种同分异构体的结构 采用电喷雾离子源(ESI)无法有效电离的农药采用大气压化学电离源(APCI)来分析 疏水性农药和氯化农药(如：五氯硝基苯和氯丹)传统上采用 GC-MS/MS 进行分析，因为采用电喷雾离子源的LC-MS/MS无法有效电离。作为参考，氯化农药的结构如图5所示。由于五氯硝基苯 (PCNB)既不含氢原子或质子，也不具有高质子亲和力或可形成氨或钠离子的功能团，因此不能采用电喷雾离子源(ESI) 图5.五氯硝基苯(a)和氯丹(b)的结构 电离。类似地，氯丹高度氯化，并且具有极低的质子亲和力，因此很难有效地采用电喷雾离子源(ESI) 进行电离。由于 APCI离子源更适合于疏水性和非极性分析物的电离，所以使用大气压化学电离源(APCI)来测定大麻中五氯硝基苯和氯丹的检测限值。此外， APCI离子源被用于对大麻中溴虫腈的低浓度分析，因为采用大气压化学电离源(APCI)与采用电喷雾离子源(ESI)相比，溴虫腈的检测限值提高了两倍，这是由于离子抑制较少的缘故。图6显示了在大麻基质中以0.1 pg/g浓度水平加入的五氯硝基苯(PCNB)，在采用具有大气压化学电离源(APCI) 的LC-MS/MS 系统分析得出的极佳信噪比(S/N>=100)。使用分析时间较短的 LC 梯度和 APCI源的快速6分钟的 LC-MS/MS方法，得出的大麻中五氯硝基苯、氯丹和氯芬酸的定量限(LOQ)分别为0.01、0.05和0.05ug/g。 LC-MS/MS 中 StayClean TM源的长期稳定数据 大麻样本中农药和真菌毒素分析的长期稳定性数据是采用LC-MS/MS 系统获得的，该系统搭配了双离子源(ESI和APCI 源))，以及由加热和自清洁相结合的、具有层流传输作用的 StayClean 源。图7显示了一周以上，在大麻提取物中添加100 ng/ml二嗪农的长期响应和稳定性。大麻中农药分析的长期稳定数据显示，大多数农药和真菌毒素在一周以上的响应 RSD 在1.5%到20%之间。这些结果表明，在LC-MS/MS系统中，加热的自清洗源可以降低通常所需要的维护需求，大多数已发布的 LC-MS/MS 方法未显示长期稳定数据，或说明其必须经常清洗电喷雾源才能保持质谱仪的灵敏度。21此外，它们在最初的几分钟内和在最后一个峰洗脱之后，将LC的流出液转移至废液中，以减少未保留的和较晚洗脱的基质化合物的污染。本研究获得了良好的长期稳定性数据，而无需在运行最初的几分钟内和运行结束后将 LC 流出液从MS中转移至废液，也无需定期清洗离子源。 图7：在大麻花基质提取物中添加 100 ng/ml 浓度的二嗪农的一周以上长期稳定数据。 结论 本研究论证了一种独特的、定量的、快速且可靠 LC-MS/MS 方法，用于分析大麻样品中不同的大麻农药和真菌毒素残留物。所提出的溶剂萃取法适用于符合加州条例规定的实验室要求，因为从大麻基质中提取的所有农药和真菌毒素的回收率 RSD 都.在 70%-120%的可接受范围内，且相对标准偏差(RSD)/小于20%。这种方法可用于定性和定量分析低浓度(0.005-0.25ug/g)的所有66种农药和五种真菌毒素，远低于加利福尼亚州确定的分析限值，且精确度较高。这种方法能对所有66种农药(包包通常采用 GC-MS/MS 方法分析的极疏水性化合物和含氯化合物)以及五种真菌毒素进行筛选和定量，成为使用单一仪器对大麻中的农药和真菌毒素进行筛选和定量的一种新颖方法。 ( 参考文献 ) ( 1. 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Cheng et Hsiao 或云连 Coptis teetaWall.的干燥根茎，是一种常用的中药。黄 连味苦，性寒，具有清热燥湿、泻火解毒之功效，用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，血热吐衄，，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。1 小檗碱被认为是黄连的主要有效成分，而药典中也使用盐酸小檗碱作为黄连药材薄层色谱鉴别的对照品。o1但是，在其他一些中药里也含有小檗碱等成分，比如川黄柏和关黄柏。2.3因此，不能简单的因为某未知药材中含有小檗碱即判定其为黄连。另外，也不能单纯的认为小檗碱含量高的黄连就是优质的药材，因为中药的疗效来自其中多种成分的协同作用，而某些指标成分的含量也可以通过添加化学合成品而得到显著的提高。总之，凭借单一或少数几个指标成分对中药进行鉴别和质量评价是不够合理的。 近年来，使用红外光谱等方法对中药进行鉴别和评价的研究日益增多。[4-6]红外光谱可以真实反映样品的整体信息，契合中医整体用药的原则，避免了只针对个别组分进行检测所产生的弊端；红外光谱指纹特征性强，适合于中药真伪品、不同产地中药等的区分鉴别，以及中药炮制过程的控制；红外光谱与化学计量学结合，可实现快速简便的成分定量分析；多种附件技术的使用，可以实现各种形态样品的无损检测；样品无需分离提取等预处理过程，操作简便，适合大量样本的快速检验。6 本应用报告里，我们使用红外光谱技术对黄连药材进行分析，结果表明该方法可以确认黄连药材中小檗碱的存在，并能对黄连、川黄柏和关黄柏三种均含有小檗碱的药材进行有效的区分。 盐酸小檗碱对照品购于 Sigma-Aldrich， 黄连、川黄柏和关黄柏药材由中国中医科学院中药研究所提供。对照品和药材经粉碎过筛后使用 PerkinElmer 公司的 Spectrum 100 傅里叶变换红外光谱仪和单次反射金刚石衰减全反射 (ATR) 附件进行测试，光谱范围4000-650cm-1，分辨率4cm-1，累加扫描1分钟以获得一个样本的光谱，使用 PerkinElmer 公司的Spectrum v10 软件对谱图进行分析处理。 图1. Spectrum 100 傅里叶变换红外光谱仪和单次反射金刚石衰减全反射(ATR)附件 结果与讨论 黄连药材与盐酸小檗碱的红外光谱比较 图2所示为黄连药材与盐酸小檗碱的红外光谱。可以看出，黄连药材的红外光谱中1507，1385，1362，1340，1271和1232 cm1等吸收峰与盐酸小檗碱的1504、1389、1363、1270 和1228cm-1等峰具有很好的对应关系，说明盐酸小檗碱在黄连药材中具有较高的含量，因此其对应的一些较强的特征峰能够在药材整体的红外光谱中表现出来。由于药材中还存在其他很多成分，因此只有较强的盐酸小檗碱的特征峰能够在药材整体光谱上看到；使用二阶导数红外光谱，可以将药材中很多重叠峰分离开，因而能够在药材整体光谱中看到更多的盐酸小檗碱的特征峰。 图3所示为黄连药材和盐酸小檗碱的二阶导数红外光谱。可以看出，药材中的1567、1506、1481、1385、1361、1328和1271 cm1等峰分别对应于盐酸小檗碱的1567、1504、1480、1388、1363、1330和1271 cm1等峰。黄连药材中所含盐酸小檗碱越多，其红外光谱与二阶导数红外光谱上后者的特征峰就会越明显。因此，根据药材的红外光谱中盐酸小檗碱的特征峰的相对强度，就可以初步判断其中所含盐酸小檗碱数量的多少。 图3.黄连和盐酸小檗碱的二阶导数红外光谱 黄连、川黄柏和关黄柏的鉴别 图4所示为黄连、川黄柏和关黄柏的红外光谱。虽然三种药材中均含有小檗碱，但是其他成分有显著的不同，所以其红外光谱的差异仍然是非常显著的。例如，川黄柏和关黄柏中1730和1600cm-1附近的峰较强，而黄连在1629 cm1有很强的吸收峰；川黄柏和关黄柏中1420 cm-1附近的峰较强，而黄连在1507 cm-1处的吸收峰强于前两者在1515cm1处的吸收峰。 使用红外光谱法与ATR附件技术，可以确认黄连中小檗碱的存在，也可以对同样含有小檗碱的三种药材进行区分鉴别。测试过程简单快速，无需对样本进行复杂繁琐的分离提取。傅里叶变换红外光谱与ATR附件技术相结合，可以为中药的质量控制提供快速简便有效的方法。 ( Re f erences ) ( 1 .国家药典委员会 ， 中华人民共和国药典 2 0 1 0 年版( 一 部) ，北 京： 中 国 医药科技出版社，201 0： 2 8 5 -2 8 6 . ) ( 2 .国家药典委员会，中华人民共和国药典2 010 年版( 一 部) ， 北京：中 国 医药科技出版社，201 0：28 6 -287 . ) ( 3 . 国家药典委员会，中华人民共和国药典2 010 年版( 一 部)，北京： 中 国医药科技出版社，2010： 13 7 . ) ( 4.孙素琴，张宣，秦竹，等.F T - I R 直接鉴别植物生药材. 光 谱学与光谱分析，199 9 ，19 ：5 4 2- 54 5. ) ( 5.孙素琴 ， 周群，秦竹.中药二维相关红外光谱鉴定图集 . 北京： 化 学工业出版社，20 03. ) ( 6 .孙素琴，周群，陈建波.中药红外光谱分析与鉴定 . 北京：化 学 工 业 出版社，20 10 . ) ( 7.陈建波，周群 ， 孙素琴， Ben Pe r s to n， P a t r i ck Cou rt n ey . 不同方法炮制黄连的红外光谱鉴别. P e rki nElm er， A p p l icati on Not e 009318 _ C HN _ 02 . ) PerkinElmer， Inc. 大中华区总部地址：上海张江高科科区李冰路67弄4号邮编：201203 电话：(800)7624000或 (021) 3876 9510 传真：(021)5895 3643 www.perkinelmer.com.cn 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：//www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs ( 版权所有 C2010， PerkinElmer， Inc.保留所有权利。PerkinElmerD 是 PerkinElmer， Inc. 的注册商标、其标所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 ) APPLICATIONNOTE FT-IR Spectroscopy Authors 陈建波，周群，孙素琴清华大学化学系，中国北京 Ben Perston Patrick Courtney PerkinElmer， Inc.Shelton， CT 06484 USA 正红花油指标成分的红外光谱定量分析 引言 正红花油是一种主要用于治疗风湿骨痛、扭伤瘀肿、跌打损伤和蚊虫叮咬等的药油，在中国和东南亚地区经常使用。冬青油、松节油、、丁香油、桂叶油是一般正红花油的主要组成。冬青油的主要成分为水杨酸甲酯(含量可高达99%，以上)，松节油主要成分是a-蒎烯和β-蒎烯， 丁香油和桂叶油的主要成分都是丁香酚。根据卫生部部颁标准 WS3-B-2699-97，要求正红花油中所含水杨酸甲酯按体积分数计不得少于33.5%，丁香酚不得少于38.0%。还有一些标准对其中α-蒎烯的含量也有所要求。由于丁香油和桂叶油成本较高，某些厂家会减少其使用量，反之会添加可工业合成因而成本低廉的水杨酸甲酯。所以，在某些质量较差的产品中，水杨酸甲酯的含量虽然很高，但丁香酚的含量却很低。 对正红花油中几种指标成分的含量进行分析时，通常使用的是气相色谱的方法，需要消耗载气和较多的测试时间，增加了检测的繁琐程度和成本。在之前的一片应用报告中1，我们使用傅里叶变换红外光谱对不同厂家的正红花油产品进行了定性分析。结果表明，作为正红花油产品质量评价的主要指标成分，水杨酸甲酯和丁香酚都有显著的特征峰，根据产品红外光谱中相应特征峰的强度，可以初步判断二者在该产品中含量的高低，从而实现产品质量的快速定性控制。在本应用报告里，我们使用红外光谱结合偏最小二乘法，对正红花油中水杨酸甲酯、丁香酚和α-蒎烯的含量进行分析，其结果与使用气相色谱方法所得结果高度一致。上说结果表明，使用傅里叶变换红外光谱结合衰减全反射(ATR)采样技术，可以对正红花油中主要的指标成分进行快速准确的定性和定量分析，大大缩短了测试所需时间，降低了正红花油质量检测的成本。 实验中用到的9个厂家生产的48个正红花油样本全部购自普通药店，其中36个样本作为校正集，另外12个样本作为独立验证集。根据文献2中描述的气相色谱实验方法测定所有样本中水杨酸甲酯、丁香酚和α-蒎烯的准确含量。 样本的红外光谱测试使用 PerkinElmer 公司的 Spectrum GX傅里叶变换红外光谱仪和硒化锌水平衰减全反射 (H-ATR)附件，光谱范围4000-650 cm²，分辨率4cm-1，累加扫描32次以获得一个样本的光谱。使用 PerkinElmer公司的QUANT+软件建立相应的定量分析校正模型。 结果与讨论 三种指标成分的红外光谱有部分重叠峰，而且产品中含有其他一些未知的成分，所以选择偏最小二乘算法进行建模。4000-650 cm-1范围内红外光谱在经过 ATR 校正处理后，不进行任何其他预处理操作或光谱范围选择，直接用于建立模型。 校正模型的建立和验证结果如表1和图1所示。在建模过程中没有发现明显异常的样本；两个水杨酸甲酯含量很低的样本虽然具有较高的权重值，但其残差很小，而且验证集中水杨酸甲酯含量较低的样本也都得到了准确的预测结果。 验证集的预测标准误差 (Standard Error of Prediction， SEP)可以看作使用该模型预测新样本时所得结果的标准偏差(standard deviations)。本模型对于丁香酚和α-蒎烯的含量预测偏差小于1%，对于水杨酸甲酯的含量预测误差小于2%，说明该方法可以对正红花油中水杨酸甲酯、丁香酚和α-蒎烯三种指标成分的含量进行准确的测量。 上述模型使用了4000-650 cm1范围内的整体光谱，涵盖了较宽的指标成分浓度范围，容纳了校正集样本中存在的具有一定含量的其他成分。如果某个新样本中存在一些含量较高的未知成分，就会被模型标记为异常样本。可以使用气相色谱等方法对这些异常样本进一步分析，并将其加入到校正集样本中，使校正模型在以后遇到此类样本时同样可以得到准确的预测结果。 表1.正红花油指标成分校正模型和验证集预测结果 浓度范围(%) 平均值(%) 因子数 交叉验证 SEP (%) 独立验证 SEP (%) 水杨酸甲酯 21.9-73.4 56.5 3 1.6 1.8 丁香酚 0-44.2 8.9 6 0.42 0.29 a-蒎烯 0-32.7 15.0 6 0.85 0.77 图1.正红花油指标成分校正模型交叉验证(上)和独立验证(下)预测结果 结论 使用红外光谱结合偏最小二乘法建立校正模型，，I可以对正红花油中水杨酸甲酯、 丁香酚和α-蒎烯的含量进行准确的测量，其结果与气相色谱方法所得结果一致。-与气相色谱方法相比，傅里叶变换红外光谱结合衰减全反射(ATR) 采样技术，在保证成分含量测试准确度的前提下，可以大大缩短测试所需时间，降低质量检测的成本，是对正红花油及其他类似产品进行简单快速质量控制的有效方法。 ( 参考 文献 ) ( 1.陈建波，周群 ， 孙素琴， Ben Perston， Pat r ick Courtney. 红外光谱在正红花油快速质量控制中的应用.PerkinElmer， Application Note 009319_CHN_ 0 1. ) ( 2. Wu YW， Sun SQ， Zhou Q， Leung HW. Fourier transformmid-infrared (MIR) and near-infrared (NIR) spectros- copy f or rapid quality assessment of Chinese medicine preparation Honghua Oil. J ournal of P harmaceutical andBiomedical Analysis， 2008，46：498-504. ) PerkinElmer， Inc. 940 Winter StreetWaltham， MA 02451 USAP： (800) 762-4000 or(+1) 203-925-4602 www.perkinelmer.com PerkinElmer For a complete listing of our global offices， visit www.perkinelmer.com/ContactUs ( C opyright O2010， Perk i nElm e r， Inc. A ll rig h t s rese r ved. Perk i nElme r @ is a re gist e red tradem a rk of Perki n Elm e r， Inc . All o t h er tr a demar k s ar e the p roperty of t h eir respect i ve o wners. ) PerkinElmer珀金埃尔默中药及天然药用植物分析文集 珀金埃尔默最新推出《珀金埃尔默中药及天然药用植物分析文集》，基于珀金埃尔默独具优势的原子光谱、分子光谱、色谱与质谱等技术在中药和药用植物分析中的深入应用，精选出涉及杂质元素、营养元素和活性成分分析，指标成分定量，农药残留和真菌毒素检测，复杂药物样品前处理，分析方法验证和药物生产中的质量控制等领域的相关文献，为中药与药用植物的安全性、有效性使用提供强有力的支持！