姜黄中UHPLCPDA分离分析检测方案(液相色谱仪)

版权所有C2019， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 使用Quasar SPP色谱柱对姜黄进行UHPLC-PDA分离分析 姜黄是植物姜黄 (Curcuma longa L.)的干根粉末，用作着色剂，使食品呈橘黄色。人们发现，姜黄是酚类化合物的丰富来源，即3种姜黄素：姜姜素(C)，去甲氧基姜黄素(DMC)和双去甲氧基姜黄素(BDMC)1。市售姜黄 素为这些天然姜黄素的混合物，其中姜黄素为主要成分(约77%)，其次是去甲氧基姜黄素(约13%)和双去甲氧基姜黄素(约3%)2。 姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的化学结构式如图1所示。 迄今为止，研究表明姜黄除了具有免疫调节作用外，还可用于预防可能导致炎症、癌症和关节炎的氧化应激。目前，人们认为姜黄素与大多数治疗中的消肿疗效有关3。近来，人们对将姜黄素转化为具有前瞻性的多能治疗应用的候选药物产生了极大的兴趣4。 本应用简报介绍了通过光电二极管阵列(PDA)检测，UHPLC色谱分离来定量检测市售姜黄香料及其根部中的三种姜黄素，并描述了样品制备及色谱分析方法。 Bisdemethoxycurcumin Demethoxycurcumin 图1姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的化学结构 实验 硬件/软件 在这项研究中使用了PerkinElmer FlexarMUHPLC系统，该系统配置有二元泵，具有Peltier冷却功能的自动进样器，柱加热器和具有10mm和50mm流通池的PDA Plus(光电二极管阵列)检测器。2.7um，4.6x100mm的PerkinElmer QuasarTM SPPC18色谱柱用于所有分析(美国康涅狄格州谢尔顿PerkinElmer)。所有仪器控制、数据分析和处理均使用PerkinElmer Chromera TMCDS软件进行。 方法参数 表1显示了所有UHPLC方法参数 溶剂和标准品 这项研究中使用的溶剂和稀释剂为HPLC级。所有标准品和样品提取物稀释液均使用50：50乙腈/水制备。用乙腈配制3种姜黄素类化合物的标准混合液。该标准混合液含有64pg/mL(ppm)姜黄素、19.2ug/mL去甲氧基姜黄素和6.4ug/mL双去甲氧基姜黄素。为了获得不同浓度的校准品，将标准混合液：姜黄素为1-32ppm，去甲氧基姜黄素为0.3-9.6ppm，双去甲氧基姜黄素为0.1-3.2ppm，在各自的浓度范围内被稀释成6个浓度水平，而这个浓度范围反映姜黄素类化合物的自然分布变化。 表1UHPLC方法参数 色谱柱 PerkinElmer Quasar SPP C18， 2.7 um， 4.6x100 mm(零件号：N9306880)溶剂A：2%乙酸的水溶液 溶剂B：乙腈 溶剂程序： 流动相 步骤 步进时间(分钟) 流速(mL/min) %A %B 0 (平衡) 5 1.0 70.0 30.0 1 13 1.0 30.0 70.0 2 2 1.0 30.0 70.0 分析时间 流速 柱箱温度 30°℃ PDA检测 进样体积 采样频率 稀释液 分析物 样品制备 准备4份样品，其中包括2种市售香料、1种纯化的粉末样品和1种研磨好的干燥根茎。分别称取30mg。溶解在50mL乙腈中，制备出浓度为0.6mg/mL的样品溶液。 结果 图2显示了3种姜黄素的分离色谱图，它们之间均很好地分离，并且对各个标准品进行了定性分析。L3标准品(8ug/mL C， 1.6ug/mL DMC，0.4ug/mL BDMC)6针进样重现性很好，其RSD值在2-4%之间。 三种姜黄素BDMC、DMC和C均做了6级校准拟合曲线。图三分别展示了它们各自的校准曲线图。而且以上给出的结果均是每个浓度的标准三次重复进样的平均值。所有3种姜黄素类化合物的R值均高于0.999(包括原点和1/x权重因子)。 每个姜黄素的定量限是基于L1浓度水平响应值的平均值来建立的(图4显示的是L1校准浓度的色谱图)所有3种姜黄素类化合物LOQ(≥10S/N)的计算值为0.04pg/mL。 图2 BDMC ，DMC，C三种姜黄素混合标准溶液液相色谱图，其中不仅混标分析展示了三种物质分离情况，而且也进行单标进样定性分析。入=425nm 图3不同浓度的三种姜黄素混标各进3针后取平均值绘制标准曲线图，浓度范围分别为：双去甲氧基姜黄素为0.1-3.2pg/mL，去甲氧基姜黄素为0.3-9.6ug/mL，姜黄素为1-32ug/mL 值得注意的是，如果要获得更低的定量限，可给PDAPlus检测器更换选配的50mm流通池，比较结果如图5所示。50mm流通池的灵敏度是10mm流通池的5倍。因此，高低浓度的样品都可以通过同一个检测器来检测，只需不费吹灰之力地更换流通池这样一个简单操作即可。 围内未发现明显的峰。市售样品的结果汇总如表2所示，而图7和图8展示了2个分析样品的色谱图，其中1个样品含有所有3种姜黄素类化合物，而另外1个样品仅含有姜黄素，这很可能是由于纯化步骤所致。 表2双去甲氧基姜黄素(BDMC)、去甲氧基姜黄素(DMC)和姜黄素(C)的结果摘要 此外，使用PDA检测器可增强结果的可信度，并允许在分析后检查测得的光谱以确认所选波长，如图6所示。 为了检查可能的分析物残留或背景干扰，分别在运行完校正样和样品后，均用50：50的乙腈/水溶液运行“空白”。在所有情况下，没有检测到分析物残留。在姜黄素类化合物出峰时间范 样品 BDMC DMC C 总姜黄素类 (ug/g) (ug/g) (ug/g) 化合物(ug/g) 姜黄粉1 0.41 0.40 1.43 2.24 姜黄粉2 0.33 0.37 1.64 2.34 干根茎 0.32 0.25 0.81 1.38 纯化粉末 (1：100稀释) 一 102.48 102.48 图5使用标配的10mm流通池和选配的50mm流通池分别检测L1浓度级别的姜黄素类化合物的比较色谱图 图63种姜黄素类化合物的光谱比较，所有3种化合物的最佳波长约为425nm 图7姜黄粉2的示例，含有所有3种姜黄素类化合物，总量为2.34ug/g(0.33ug/g BDMC、0.37ug/g DMC和1.64ug/gC) 图8纯化姜黄粉提取物的样品，仅含有102.48ug/g姜黄素(1：100稀释) 结果 ·FFlexar PDA Plus检测器增强了结果的可信度，并以高数据采集速率(高达200 Hz)进行检测，并具有线性和高度可重复的响应。 ●模块化流通池设计可轻松更换流通池，在检测浓度范围较宽的样品时，50 mm流通池展现出了优异的灵敏度，并且无需使用其他类型的检测器。 ·Quasar SPP 液相固定相可高效分离天然姜黄素类化合物(姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素)。 特别感谢Carlo Meroni博士， BAI srl-Carate Brianza(意大利)对本应用说明开发的支持。 ( 参考文 献 ) ( Wichitnithad，W.、Jongaroonngamsang，N. Pummangura， S.和Rojsitthisak， P.2009，一种简单的等 度洗脱HPLC方法，用于同时测定商品姜黄提取物中的姜 黄素。《光化学》年刊20，314-319. ) ( Sandur， S .K.， Pandey， M .K.， Sung， B.， A hn， K.S.， Murakami， A.， S e thi， G . ， Li m trakul， P . ， B admaev， V.，Aggarwal， B.B.， 2007.姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧 基姜黄素、四氢姜黄素和姜黄酮通过ROS-independent 机制差异性调节抗炎和抗增生反应。《肿瘤学》28， 1765-1773. ) ( Rahmani， A . H.， Alsahli， M .A.， A ly， S.M.， Khan， M.A.， Aldebasi，Y.H.， 2018.姜黄素在疾病预防和治疗中的作用。 《高级生物医学研究》7， 38Gryn k iewicz， G.， Slifirski， P.， 2012.姜黄素和姜黄素类药物具有药用价值。《生物化学学 报》59，201-212. ) 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号 邮编：201203 电话：021-60645888 传真：021-60645999 ww.perkinelmer.com.cn PerkinElmer ( 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：/ / www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs ) 本文介绍了通过光电二极管阵列（PDA）检测，UHPLC色谱分离来定量检测市售姜黄香料及其根部中的三种姜黄素，并描述了样品制备及色谱分析方法。