重组腺相关病毒rAAV中定量分析检测方案

采用强阳离子交换色谱柱 TSKgel SP-NPR 分析重组腺相关病毒 重组腺相关病毒Recombination adeno-associated virus，rAAV 【基本信息】 腺相关病毒也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链 DNA 缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。目前用于定量的标准生物分析方法需要3天的感染期和1天的分析时间，这成为快速工艺优化的主要障碍。这里采用无孔强阳离子交换色谱法，建立了一种快速定量分析方法门，分析时间可缩短到20 min 以内。 【样品制备】 重组腺相关病毒2型(rAAV-2)参考方法[2]制备。 【分析条件】 色谱柱：： TSKgel SP-NPR (4.6 mmI.D.×3.5 cm， 2.5 um) 流动相A： 50mMHEPES，，1mMEDTA， 5mMMgCl， 100 mM NaCl pH 7.5 流动相B： 50 mM HEPES，， 1mMEDTA， 5mM MgCl， 500 mM NaCl pH 7.5 流速：1.0 mL/min 柱温：：室温 检测器参数： UV @280 nm 样品：重组腺相关病毒2型(rAAV-2) 进样量：：10-100 uLL((1.0×10" DRP) 图1纯化后rAAV-2载体分离色谱图 图2 rAAV-2载体校正曲线 【结果与讨论】 采用无孔强阳离子交换色谱柱 TSKgel SP-NPR对重组腺相关病毒2型载体进行定量分析，实验结果表明，该方法可以在 20 min 内完成一次分析(图1)；定量线性范围较宽(1.0×1010-5.0×10"DRP，R2值 0.997)(图2)，可适用于稀释和浓缩样品的分析。收集流出峰紫外光谱与进样样品紫外光谱一致，感染率无明显变化，说明病毒载体分析后仍保留活性。该方法可广泛用于过程开发、基因治疗用重组腺相关病毒的纯化与分析。 ( 参考资料： ) ( 1. D. Debelak， J. Fisher， S. Iuliano ， D. Sesholtz， D. L. Sloane， E. M. Atkinson， J . Chromatogr. B， 740 (2000) 195-202.2. K. R. Clark， F. Voulgaropoulou， D.M. Fraley， P.R. Johnson， Human Gene Ther. 6 ( 1 9 95) 1329-1341. ) 采用无孔强阳离子交换色谱柱TSKgel SP-NPR（4.6mmI.D.×3.5cm，2.5μm）对重组腺相关病毒2型载体（rAAV-2）进行定量分析。实验结果表明，该方法可以在20 min内完成一次分析；定量线性范围较宽，可适用于稀释和浓缩样品的分析。收集流出峰紫外光谱与进样样品紫外光谱一致，感染率无明显变化，说明病毒载体分析后仍保留活性。该方法可广泛用于过程开发、基因治疗用重组腺相关病毒的纯化与分析。