酒类中变质分析检测方案(液质联用仪)

LAAN-A-LM175 Application No.C203News http：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2019年10月400-650-0439 ApplicationNews 营养代谢组学利用 LC/MS/MS 进行酒类变质分析 No，.C203 近年来，代谢组学技术因其能全面分析体内代谢产物而成为研究热点。营养代谢组学则是将该项技术应用用食品领域，并以此为基础而发展起来。一直以来，人们在评价食物时，都是根据人的感观分析，即通过味道、香气、口感、等级等进行评价。所谓营养代谢组学，是通过全面分析食品中的代谢产物，并与人类感官分析等评价结果进行比较，从而更加科学地进行食品的“品质评价预测”与“机能性成分的探索”。 本研究将介绍一种采用营养代谢组学进行食品变质解析的分析方法。实验中，将市售日本清酒与白葡萄酒在不利条件下保存后，采用高效液相色谱质谱联用技术 (LC/MS/MS)对其进行整体分析，全面考察氨基酸、有机酸、核苷、核苷酸等亲水性代谢产物的变化。 N. Kato Y. Inohana |样品与变质实验 样品选取两种市售日本清酒(冷藏)和一种白葡萄酒。样品详细情况如表1所示。为了加快变质实验，将样品按照表2所示的各种实验条件进行保存。目前，酒类产品在国内外均有销售，并存在大量的进口与出口销售。因此，这些酒类产品在运输过程中要保证其品质不受损，才能保持商品价值。本研究中使用的实验条件，将再现日照、高温、震动等运输时可能会影响品质的状况，并对其进行评价。 对各条件下存放的样品，以12，000 rpm/min 离心5 min，取上清液用超纯水稀释100倍后， 使用 LC/MS/MS进样分析。 表1样品详细情况 样品 日本清酒-1 纯米大吟酿(品质上乘的清酒)， 精米打磨精度=50%，酒精度=15度 吟酿酒，酿造酒精添加，精米打磨精度=50%， 日本清酒-2 酒精度=15度 澳大利亚生产、含有防氧化剂(亚硫酸盐)， 白葡萄酒 酒精度=13度 表2样品变质实验条件 存放条件 A 冷藏、避光条件下存放2周 B 室温、日照下存放2周 C 冷藏、避光条件下存放2周后，加热至50℃、 避光保存24h 冷藏、避光条件下存放2周后，室温、避光条件下 D 振荡24h 分析条件 利用初级代谢产物 LC/MS/MS Ver. 2 方法包中含有的液质采集方法，采用LCMS-8060(图1)进行实验。通过使用方法包中的分析方法，可实现对生命科学领域中已知重要的97种亲水性代谢产物同时进行检测分析。 HPLC 及MS的分析条件见表 3. 表3分析条件 [HPLC conditions] (NexeralM X2) Column ： Reversed-phase column Mobile phases ： A) 0.1% Formic acid in water B) 0.1% Formic acid in acetonitrile Mode ： Gradient elution Flow rate ： 0.25 mL/min Injection volume ：3uL [MS conditions] (LCMS-8060) lonization ： ESI (Positive and negative mode) Mode ： MRM Nebulizing gas flow ： 3.0L/min Drying gas flow ：10.0L/min Heating gas flow ： 10.0L/min DL temp. ： 250℃ Block heater temp. ：400℃ Interface temp. ：300℃ 图1 NexeraTM X2及 LCMSTM-8060 代谢组分析 利用LC/MS/MS 检测各样品。根据各成分峰面积，结合 Traverse-MS软件进行主成分分析 (Principal ComponentAnalysis： PCA) 和单因素方差分析(one-way ANOVA)。 经过主成分分析，结果表明，在不同存放条件下储存的所有酒类样品未产生明显的差异。相比之下，详细的方差分析结果显示，一些成分的增加或减少与酒类样品的类型及储存条件有关。以日本清酒-1为例，储存条件对其影响的方差分析结果如图2所示。图中绿色框表示不同保存条件下各组分的检测结果 (p<0.05)，差异具有统计学意义。 图2不同储存条件对日本清酒-1中各组分影响的方差分析结果 本实验中，在室温、日照的条件下存放2周(储存条件B)的日本清酒-1样品中，检测到部分成分与保存在其他条件下的样品有显著性差异。日本清酒-2和白葡萄酒也观察到类似的趋势。实验结果显示一些储存条件，如加热至50°C或振荡约24小时，并不足以对包括氨基酸和有机酸在内的亲水化合物产生显著影响。仅仅根据这项研究的结果很难得出明确的结论。然而，结果表明，在购买产品后的运输或储存过程中，即使产品偶然暴露在高温、震动等条件下，也不太可能在短时间内对产品质量产生重大影响。 在日本清酒-1中，储存B条件下与其他条件下出现显著性差异(p<0.05)的成分有：半胱氨酸、蛋氨酸亚砜、尿酸。此外还观测到了白葡萄酒特有的变化成分。各酒类样品中变化成分的比较结果如图3至图6所示。 2 图3蛋氨酸亚砜的方差分析结果 图3所示为蛋氨酸亚砜在各类酒中的统计分析结果。分析结果表明，无论何种类型的酒类样品，在室温、日照的条件下存放2周(储存条件B)的样品中，蛋氨酸亚砜有明显增加的趋势。蛋氨酸是一种氨基酸残基，更容易发生老化相关氧化，因此被认为是体内氧化蛋白损伤增加的原因之一，在细胞内氧化应激条件下可迅速氧化为蛋氨酸亚砜。由此可知，蛋氨酸亚砜可作为酒类成分氧化标志物进行使用。 2×10 =11x10 图4尿酸的方差分析结果 图4所示为尿酸在各类酒中的统计分析结果。分析结果表明，只有日本清酒在室温、日照的条件下存放2周(储存条件B)的样品中，尿酸成分有明显减少的趋势。尿酸在生理学上，具有与L-抗坏血酸同样的强抗氧化作用，其自身具有易氧化的特性。由于白葡萄酒中添加了亚硫酸盐作为防氧化剂，因此尿酸本身几乎没有被氧化。 p-value： 0.19 8 4x10 -2x10 Cysteine 图5半胱氨酸的方差分析结果 图5所示内容为半胱氨酸在各类酒中的统计分析结果。分析结果表明，只有日本清酒-1在室在、日照的条件下存放2周(储存条件B)的样品中，半胱氨酸中有明显减少的趋势。除了蛋氨酸，半胱氨酸也是变质的日本清酒产生恶臭的主要成分二甲基三硫 (DMTS)的前体物质。如果半胱氨酸的减少会影响 DMTS 的生成，那么作为日本清酒-1与日本清酒-2的主要差别——酿造清酒是否添加，可会影响清酒变质的敏感程度。 图6白葡萄酒中色氨酸及犬尿氨酸的方差分析结果 图6所示为白葡萄酒中色氨酸及犬尿氨酸的统计分析结果。分析结果表明，在室温、日照的条件下存放2周(储存条件B)的样品中，色氨酸减少，犬尿氨酸提高。冷藏、避光条件下存放2周后，加热至50℃、避光条件下保存24h(储存条件C)的样品也稍显与之相同的变化趋势，但变化幅度较小。色氨酸可通过犬尿氨酸的一条代谢途径代谢为犬尿氨酸(见图7)。因此，本研究观测到的这些成分的变化，和通过它们与该条代谢通路的关系所预测的变化相一致。 |结论 综上所述，利用 LC/MS/MS 进行营养代谢组学研究，可实现对酒类变质特征性成分的整体探索分析。 图7犬尿氨酸代谢途径 近年来，代谢组学技术因其能全面分析体内代谢产物而成为研究热点。营养代谢组学则是将该项技术应用在食品领域，并以此为基础而发展起来。一直以来，人们在评价食物时，都是根据人的感观分析，即通过味道、香气、口感、等级等进行评价。所谓营养代谢组学，是通过全面分析食品中的代谢产物，并与人类感官分析等评价结果进行比较，从而更加科学地进行食品的“品质评价预测”与“机能性成分的探索”。本研究将介绍一种采用营养代谢组学进行食品变质解析的分析方法。实验中，将市售日本清酒与白葡萄酒在不利条件下保存后，采用高效液相色谱质谱联用技术（LC/MS/MS）对其进行整体分析，全面考察氨基酸、有机酸、核苷、核苷酸等亲水性代谢产物的变化。