疫苗领域中疫苗领域检测方案(蛋白质纯化)

层析设备选择指南(工艺阶段) GE 产品在疫苗领域的选择应用指南 gehealthcare.com 目录 .疫苗细胞培养基选择. .1 疫苗一次性细胞培养设备选择. .2 .疫苗过滤中空纤维选择. .5 疫苗过滤设备选择. .6 疫苗新层析介质选择. .7 疫苗层析设备选择. .9 .疫苗质控设备选择.. 11 疫苗领域上游细胞培养产品-耗材试剂选择 GE HyClone 品牌创立于1967年，总部位于美国犹他州洛根市，是细胞培养和相关产品的全球供应商，并为生物制药的研究与生产提供支持。2014年HyClone品牌正式并入 GE 医疗集团。近50年来，HyClone 一直是高品质胎牛血清(FBS)及其他血清产品行业的领导者。同时， HyClone 还可提供各类经典细胞培养基、不断更新的无血清和无蛋白培养基，并且可以根据客户的配方要求定制生产培养基，全方位的满足科研及生物制药领域的细胞培养需求。 在细胞培养过程中，与可以进行纯悬浮培养的动物细胞相比，贴壁依赖型动物细胞在放大及规模化生产过程中面临着更大的技术挑战：传统的转瓶 GE微载体技术 (Microcarrier) 的应用为生物制品生产提供了新的选择。这是一种用于高密度细胞培养的实用技术，搭配 Hyclone 培养基能够实现贴壁细胞的悬浮培养，每毫升培养液可培养数百万贴壁细胞，满足不同疫苗产品的研发和生产的需要。 疫苗上游培养相关产品选择列表 细胞系 培养基名称 产品描述 血清 微载体 Vero Vaccine-express 无血清 胎牛血清 新生牛/小牛血清 Cytodex 1 & 3 Cytodex 1 & 3 Gamma SFM4MegaVir 无血清 现有新西兰优 等胎牛血清和 乌拉圭优等胎 牛血清，胎牛 品质优良，营养极为丰富，2种适用于多种细胞培养基，满足细胞的多种营养需求，7在疫苗生产过程中，细胞库建立，扩增， 毒种制备应用 非常广泛。 现有新西兰新生牛血清、新西兰补铁新生牛血清以及新西兰小牛 清.3种血清营养丰富，性价比非常高，在细胞传代培养中使用广泛，能够提供细胞充分的营养，在疫苗生产中有广泛5的使用。 Cytodex 支持 多种贴壁细 胞高密度培 养和高滴度 的病毒生产， 可以实现大 规模放大培 养，较传统 工艺，显著 减少人力成 本和厂房建 设成本，提高生产效率。 与标准的 Cytodex 1 产 品相对比，经射线灭菌 的 Cytodex Gamma 微 载体可以省去大量的微 载体的准备和灭菌时 间，微载体可直接加入 生物反应器中，可快速启动培养，在一次性培 养系统中培养贴壁细胞 生物反应器，可消除清 洗和清洁验证工作。 MEM/EBSS， 含谷氨酰胺 经典 2BS MEM/EBSS，含谷氨酰胺 经典 Mrc5 MEM/EBSS， 含谷氨酰胺 经典 SF9/21High5 SFX-Insect 无血清 SFM4Insect 无血清 BHK Vaccine-express 无血清 SFM4MegaVir 无血清 MDCK CM205 无血清 EB66 CDM4Avian 无血清 PK15 DMEM， 含谷氨酰胺 经典 ST MEM/EBSS， 含谷氨酰胺 经典 Marc145 DMEM， 含谷氨酰胺 经典 疫苗领域一次性上游细胞培养产品一设备选择 波浪式摇摆方式剪切力低，温柔呵护细胞； 气液接触面积大，溶氧传递系数高； 双培养模式，一台 WAVE 两种应用； 人体工程学设计方便安装和维护； 高精度检测器、蠕动泵及气体混合单元为培养过程保驾护航； 自动化编程运行，无人值守； 符合 21CFR Part 11 对电子数据完整性的要求； ae 支持 Batch/Feed batch/Perfusion培养方式； 培养范围：300ml-25L； ReadyToProcess WAVE 25 波浪式生物反应器 可培养贴壁细胞、悬浮细胞及微生物，广泛应用于VERO 细胞、HEK 293 细胞、SF9细胞、大肠杆菌等培养过程； 多种细胞培养袋可供选择，满足不同工艺； 接液层材质为超低密度聚乙烯，通过E&L测试，符合USPVI等法规要求； 完善的法规支持文件。 WAVE 细胞培养袋 XDR细胞培养袋 XDR 10-2000L搅拌式生物反应器 磁力耦合底搅拌方式，最小培养体积仅为罐体体积的20%； 斜15°搅拌桨，自润滑无轴封，避免涡流，提高传质效率； 底通专利同轴同向设计，高KLA；高精度称重单元关联蠕动泵进行反馈补料； 自动化编程运行，无人值守；符合21CFR Part 11 对电子数据完整性的要求； 支持 Batch/Feed batch/Perfusion 培养方式； 设备型号：10L/50L/200L/500L/1000L/2000L； 可培养贴壁细胞、悬浮细胞，广泛应用于 VERO 细胞、HEK 293 细胞、SF9细胞等培养过程； 50L/200L/500L 同时具有微生物培养型； 多种细胞培养袋可供选择，满足不同工艺； 接液层材质为超低密度聚乙烯，通过E&L测试，符合 USPVI等法规要求；双物理层，双重保护完善的法规支持文件。 立方体设计，挡板效应提高混合效率； 磁力耦合搅拌轴，自润滑无轴封泄露； 可选配五面水夹套，温度均一；可选配 pH、电导、重量和温度监测或控制功能；额外选择温度控制单元可做精准控温；XDUO具有审计追踪功能；可选配漏斗或投料袋降低粉尘飞扬；广泛应用于培养基、缓冲液和佐剂的配制及中间样品的暂存；设备型号：50L/100L/200L/500L/1000L/2000L 接液层材质为超低密度聚乙烯，通过E&L测试， 符合 USPVI等法规要求；双物理层，双重保护 完善的法规支持文件。 支持热塑管的无菌连接和断开。 多种管托，支持管道外径1/4in、5/16 in、3/8in、7/16 in、1/2 in、9/16 in、5/8 in、3/4 in、7/8 in 操作简便 ReadyKart工作站 XDM/XDUO欠次性混合系统 无菌接管机与封口机 一次性移动工作站： 可选配储液袋、储液桶、死端滤器、蠕动泵、中空纤维滤器、一次性电导检测器、·一次性压力检测器、-一次性温度检测器、、一次性管道进行连接，用于细胞收获、澄清、浓缩等应用； 可选耗材： 250ml/500ml/1L/5L/10L/20L/50L 2D 储液袋； 接液层材质为超低密度聚乙烯，通过E&L测试，符合USPVI等法规要求； 所有一次性耗材均可 Gamma 射线辐照。 一次性储液桶： 设备范围：100L/200L/500L/1000L 耗材：50L/100L/200L/500L/1000L 3D 储液袋 接液层材质为超低密度聚乙烯，通过 E&L测试，符合 USPVI等法规要求； 所有一次性耗材均可 Gamma 射线辐照。 ReadyToProcess Bin 储液桶 ReadyMate 无菌快接头可满足任意环境下的无菌对接要求； 可接受 Gamma 射线辐照或是高温高压灭菌； 型号：1/4”、3/8”、1/2”、3/4”、TC 25、TC 50快接头不分公母，可直接变径。 ReadyMate 无菌快接头 疫苗领域切向流过滤中空纤维选择 中空纤维膜由于其独特的开放式流道，温和的低剪切力操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，特别有利于保护大分子病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除，目前已经广泛地应用于各种病毒或 VLP疫苗的微滤澄清和超滤浓缩/换液等步骤，比如狂犬病毒、流感病毒、轮状病毒 VLP浓缩，腺病毒和乙肝病毒浓缩，口蹄疫病毒浓缩，猪圆环VLP， HPV VLP等等。具体应用和选择请参照如下表1. 表1中空纤维膜在新型疫苗中的应用选择* 病毒/VLP 颗粒大小 建议使用 澄清膜柱孔径 建议使用 浓缩膜柱孔径 典型疫苗示例 ≤ 30nm 100kD， 300kD， 人用：肠道病毒(EV71)，脊灰病毒，甲肝病肝(HAV) 等； 0.2um， 0.45pm 动物用：猪圆环病毒(PCV2)，犬/猫/猪细小病毒，猪/牛 口蹄疫病毒(FMDV)，水貂肠炎病毒等. 人用：风疹病毒，乙肝病毒(HBV)，轮状病毒(RV)，脑炎病毒(JEV)，黄热病毒，乳头瘤病毒(HPV)等；动物用：猪蓝耳病毒，猪瘟病毒等. 人用：麻疹病毒，腮腺炎病毒，水痘带状疱疹病毒流感病毒，狂犬病毒，天花病毒等； 动物用：禽流感病毒，水貂犬瘟热病毒，猪伪狂犬病毒，羊痘病毒，鸡新城疫病毒等. 500kD 30nm-80nm 0.45pm，0.65pm 300kD，500kD， 750kD ≥80nm 0.65pm 750kD *具体疫苗类型、中空纤维使用参数和系统的选择请联系 GE Healthcare代表。 在疫苗的不同阶段处理体积量差别也较大，也需要对应的不同膜面积来年满足对应的需求。 表2中空纤维膜面积选择* 工艺阶段 膜类型 面积 处理体积* 研发阶段 Start AXM Start AXH 40/50cm ，16-73 cm’ 20-500mL以上 中试阶段 3，4号膜柱 5，6号膜柱 110-1400cm，0.12-0.48m° 500mL-50L以上 生产阶段 8，9号膜柱 35，55，75号膜柱 45，65，85号膜柱 0.36-1.15m ，0.92-6m， 20L-1000L 以上. 2.5-13m *此处的处理量基于常见相对澄清的料液，具体料液的处理量需根据试验计算 疫苗领域切向流过滤设备选择 中空纤维膜在疫苗领域的应用已经在众多人用和动物用疫苗品种里得到了充分的认可，但是作为切向流过滤的典型技术代表，中空纤维在使用时还要考虑剪切力(Shear rate)，切向流速(Cross flow)，过膜压力(TMP)， 洗滤 (Diafiltration)等诸多参数，如果采用完全手动的操作方式，不但对诸多参数不能很好的控制，而且对工艺中出现的问题也不能有效地追溯解决，更不用提数据管理等 GXP要求，所以对于疫苗领域中空纤维的工艺中多使用半自动化或自动化过滤系统，如何在不同的阶段以及规模选择合适的系统是极其重要的。 在工艺开发阶段，主要用于筛选合适的材质、孔径的膜以及优化处理条件，此时处理的料液量较少，待优化参数较多，选择系统时主要考虑到系统的兼容性，以及可拓展性，例如 Feb-Batch 的处理模式，透过端优化。 在中试工艺验证阶段，此时主要的工作是进行工艺放大的验证及稳定性研究，此时处理的料液量也较大，另外在此阶段，很多品种也会做小规模的 GMP生产，需要设备具有可追溯的材质证明，避免溶出析出物对于目的产品的影响。 在生产阶段，这时新疫苗均会会 GMP车间中生产，这样对于设备的要求不仅需要硬件和软件的稳定，保证每年的生产批次任务，同时对于设备的自动化要求也较高，需要超滤设备具有与上下游罐体可以信号联动，实现整个工艺的自动化。在生产阶段，不同的疫苗处理量差异较大，所以在此规模很多超滤设备都是根据需求进行特别定制。 超滤设备选择指南 工艺阶段 目的及要求 澄清超滤设备 设备流速范围 中空纤维膜柱 筛选膜柱 工艺开发 材质、孔径 AKTA Flux S 20-350ml/min Start AXM/AXH MidGee/MidGee 筛选条件 TMP AKTA Crossflow 1-600ml/min Hoop 浓缩洗滤 中试阶段 技术转移， 工艺验证 卫生级设计 AKTA Flux 6 100-6000ml/min 3，4号膜柱 5，6号膜柱 生产阶段 产品制备 0.2-18L/min 8，9号膜柱 稳定 AKTA Ready Flux 定制超滤设备 根据工艺要求选择合35，55，75号膜柱 自动化 符合法规 适流速的泵 45，65，85号膜柱 AKTA FluxS AKTA Flux 6 AKTA Ready Flux 疫苗领域层析新介质选择 疫苗领域层析设备选择 在现在大多的人用疫苗生产工艺中，基本上都会使用层析分离技术来提高产品的质量。在开发层析工艺时，除了要选择合适的填料、纯化条件外。在工艺的不同阶段、不同处理量，选择合适的层析设备也是非常重要的。 基于工艺阶段选择设备，基本上根据不同工艺阶段的目的，选择合适的设备。 在工艺开发阶段，主要用于筛选合适的分离方法及优化条件，此时选择系统时主要考虑到自动的筛选的功能，比如 DOE， Scouting 等功能。层析柱在选择时也考虑对不同填料的兼容性。 在中试工艺验证阶段，此时主要的工作是进行技术转移和工艺稳定性的研究，对于系统和层析柱的要求主要为稳定，以及材质的可追溯性。此外，中试阶段的设备有可能会做多个新疫苗产品的工艺验证，此时需要设备可作完全清洁，避免通过不同产品之间的交叉污染，这方面可通过设备是否通过细菌挑战试验验证。 在生产阶段，这时新疫苗均会在 GMP车间中生产，这样对于设备的要求不仅需要硬件和软件的稳定，保证每年的生产批次任务。对于设备符合法规也会有要求，需要符合行业法规的 ASME BPE的规定，可提供按照 ASME BPE 要求的设计，材质，计算机系统等的文件体系，保证生产的产品的安全性。 层析设备选择指南(处理量) 设备 流速 层析柱类型 兼容层析柱 处理量* AKTA Pure Hitrap/HiScreen AKTA pure/ 开发工艺路线 DoE， Scouting AKTA Avant XK/HiScale AKTA Avant 可线性放大设计 AKTA Pilot 600S Axichrom70 可追溯 HiScale AKTA Pilot 600R 技术转移，工艺验证 细菌挑战试验 AKTAPilot 600R Axichrom 可线性放大设计 BPG 生产阶段 产品制备 稳定 符合行业法规的文件体系 可线性放大设计 AKTA Process BPG Chromalflow Axichrom AKTA Process 6mm 4-180 L/hr BPG， Axichrom 100mm-300mm 0.3L-3L AKTA Process10 mm 15-600 L/hr BPG，Axichorm， Chromaflow 140mm-600mm 0.6L-11.5L AKTA Process 1 Inch 45-2000 L/hr BPG，Axichorm，Chromaflow 450mm-1000mm 6L-30L *此处的处理量基于分子筛的分离方式进行的估算，处理批次基于一次。 不同的阶段，层析处理的料液量也有不同。基于处理量选择设备相对简单一些，基本上考虑层析系统的流速，层析柱的直径，以及填料载量选择即可。下表以疫苗中常用的分子筛分离方法，显示的在不同处理量层析设备和层析柱的选择方案。 工艺阶段 目的 层析设备要求 层析设备 层析柱 DoE， Scouting AKTA Pure Hitrap/HiScreen 工艺开发 开发工艺路线 AKTA Avant AKTA Pilot 600S XK/HiScale Axichrom70 可线性放大设计 中试阶段 技术转移，工艺验证 可追溯 细菌挑战试验 可线性放大设计 AKTAPilot 600R HiScale Axichrom BPG 生产阶段 产品制备 稳定 符合行业法规的文件体系 可线性放大设计 AKTA Process BPG Chromalflow Axichrom AKTA Avant AKTA pilot 600 AKTA process 疫苗领域质控设备选择一分子互作技术 Biacore 的应用 在疫苗的生产环节与批次放行中，需要高质量的分析工具来对疫苗的收率、产量、纯度及效价等进行准确定量。基于 Biacore 平台，可以建立疫苗的全面质控标准。 Biacore 采用的 SPR技术是美国、日本药典唯一认可的分子互作分析技术。Biacore 出色的检测性能和数据重复性，满足了质量控制对数据可靠性的要求。 1.活性浓度定量 Biacore 有两种浓度测定模式。一是基于标准曲线的活性浓度分析，通过结合响应与标准品浓度之间的定量关系获得样品的活性浓度。二是 Biacore的专利方法，即无需标准曲线的浓度分析技术，通过表观结合速率获得样品的活性浓度，适合无法获得标准品或建立标准曲线的情况。 标准曲线法 无需标曲法 以流感疫苗的抗原定量为例，将 HA 蛋白偶联于芯片上，孵育血清与等量 anti-HA 抗体后进样，测定游离 anti-HA 抗体的含量建立标准曲线。样品病毒含量越高， Biacore 的响应信号越低，由此可以测定出流感抗原的含量. 与经典的单向免疫扩散法 (SRID) 相比， Biacore 具有更高的灵敏度和准确性。LOD 和 LOQ较 SRID 法相比均降低了一个数量级，准确度高达95%-105%。 Table 1. Comparison of Biacore and SRID assays Biacore SRID Standard curve range 0.5 to 10 pg HA/ml 5 to 30 pg HA/ml Sensitivity Limit of detection 0.5 pg HA/ml 5pg HA/ml Limit of quantitation 1.0 pg1 HA/ml 10 pg HA/ml Precision Number of samples CV <5% 97 18 Recovery 95% to 105% 90% to 110% Time for 100 samples Hands-on 1to 2h 6 to 8h Total ~17 to 18 h ~ 20 to 22 h 检测疫苗的免疫原性也是效价评价的关键指标，即检测疫苗注射后产生的抗体含量。例如，通过疫苗注射可以使宿主产生抗 IgE 的抗体从而减弱宿主的过敏反应。基于 Biacore 技术可以直接进样血清样品，实时检测免疫后12周的血清中抗体的含量和变化。 2工.艺中的杂质含量也会引起产品质量的改变。例如检测工艺不同环节的 HCP含量，也是质量评价的一部分。基于 Biacore精确的浓度定量模块，只需将 anti-HCP抗体固定于芯片表面，即可轻松准确地完成 HCP含量检测。 HCP 定量实例 综上所述， Biacore 平台可以协助疫苗企业建立全面的质控标准，对疫苗生产环节与批次放行中需要检测的各项效价指标进行准确定量。与传统方法相比， Biacore 具有更出色的检测性能和数据重复性，满足质量控制对数据可靠性的要求。 Biacore T 200 关于GE医疗集团 GE医疗集团通过提供革新性的医疗技术和服务，开创医疗护理的新时代。我们在医学成像、信息技术、医疗诊断、患者监护系统、药物研发、生物制药技术、卓越运营和整体运营解决方案等领域拥有广泛的专业技术，能够帮助客户以更低的成本为全世界更多的人提供更优质的服务。此外，我们还和医疗行业领袖一道，正努力通过全球政策，打造成功的、可持续的医疗体系。 我们的“健康创想”愿景普及全球。我们不断通过创新在世界范围内推动降低医疗成本、增加医疗机会、提供医疗质量。GE医疗集团总部设在英国，是通用电气公司(纽约证券交易所： GE)下属的业务集团之一。GE医疗集团的员工分布于全球100多个国家和地区，致力于为医疗专业人士和患者服务。 www.gelifesciences.com.cn 咨询热线：800-810-9118400-810-9118 北京办公室上海办公室广州办公室成都办公室北京市经济技术开发区上海市浦东新区张江高科技园区广州市天河区珠江新新花城大道87号成都市高新西区西芯大道3号同济南路1号华佗路1号通用电气大厦10楼创智联邦3号楼邮政编码：100176邮政编码：201203邮政编码：510623邮政编码：611731电话：010-58068888电话：021-38777888电话：020-38157777电话：028-62722345传真：010-67873597传真：021-38777499传真：020-38157797传真：028-62722466 ( (本资料仅限科 研 或工 业 使用) ) O[2017]通用电气公司 (General Electric Company) GE， GE Monogram，是通用电气公司 (General Electric Company) 的商标。未经通用电气(GE)公司事先的书面许可，不得以任何方式进行复制或再造。该资料中任何内容不应被使用于诊断或治疗任何的病情或疾病。读者请务必咨询医疗卫生专业人士。 通用电气 (GE)公司有权在任何时候，在不另行通知的情况下，不负有任何义务地对上述规格和性能等进行更改，并有权终止该产品的供应。详情请与您当地的 GE 业务 疫苗细胞培养基选择 ....................................................................................1疫苗一次性细胞培养设备选择 ................................................................2疫苗过滤中空纤维选择 ...............................................................................5疫苗过滤设备选择 ..........................................................................................6疫苗新层析介质选择 ....................................................................................7疫苗层析设备选择 ..........................................................................................9疫苗质控设备选择 ....................................................................................... 11