猪组织中恶喹酸检测方案(液相色谱仪)

苏美丞，贾曼，陈刚 中国农业科学院农业质量和标准 检测技术研究所 吴翠玲，肖尧，张聪聪 安捷伦科技(中国)有限公司 李丹 中国兽医药品监察所 使用固相萃取结合液相色谱荧光检测器对猪组织中的氟甲喹和恶喹酸残留进行分析 噁喹酸和氟甲喹属于第二代喹诺酮类抗菌药，氟甲喹也是目前唯一不与人类共用的一种广谱型抗菌兽药，属于氟哌酸的替代产品。这类药物具有很强的杀菌活力，对动物的细菌性疾病有很好的疗效。这类药物一般毒性较低，安全范围大。但是随着噁喹酸和氟甲喹在兽医临床上的广泛应用，由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟、日本及我国均制定了其在动物组织中的最高残留限量。农业部第235号公告中规定的猪肉肌肉、肝脏和脂肪组织中氟甲喹的最大残留限量分别为500 ug/kg、500 pg/kg 和1000 pg/kg， 猪肌肉、肝脏和脂肪组织中噁喹酸的最大残留限量则分别为 100 ug/kg、50 pg/kg 和 50 pg/kg。 本方法采用 Agilent Bond Elut C18 固相萃取柱结合液相色谱-荧光检测器，成功开发出了不同猪组织中氟甲喹和噁喹酸的分析方法。该方法的样品前处理流程和色谱条件如图1和表1所示。 称取试料(2±0.05)g， 置于50mL离心管中，加入10.0 mL 磷酸盐缓冲液及陶瓷均质子 涡旋混匀并中速振荡5min， 15000 r/min 离心 10 min 取上清液于另一50mL离心管中，向残渣中加入 10.0 mL磷酸盐缓冲溶液，重复提取一遍 合并两次上清液，涡旋混匀，定容至20mL， 15000 r/min 离心10 min， 取上清液备用 Agilent Bond Elut C18柱(100mg，3mL) 活化：2mL甲醇， 2 mL 水 耳6mL上清液过 SPE 柱，2mL水淋洗，挤干过滤滤，2mL洗脱液*洗脱，接收洗脱液 过 Agilent Captiva RC 滤膜 (0.2 pm)后， 进行LC-FLR分析 *洗脱液： 0.02mol/L 磷酸溶液：乙腈：四氢呋喃= 68：16：16 图1.样品前处理流程图 表1.液相色谱条件 色谱 Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色谱系统 检测器 荧光检测器(FLR) 色谱柱 Agilent Zorbax Elipse PLus C18， 250 mmx4.6 mm， 5 pm 流动相 0.02 mol/L 磷酸溶液：乙腈：四氢呋喃(68：16：16)，使用前经 0.2 pm 微孔滤膜过滤 流速 0.8 mL/min 检测波长 激发波长325nm， 发射波长：369 nm 柱温 30°C 20 pL 进样量 20 pL 该方法在噁喹酸、氟甲喹 5-500 ng/mL 范围内表现出良好的线性，如图2所示。 图2.噁喹酸、氟甲喹的标准曲线 从图3的色谱对比图中可以看出， Agilent Bond Elut C18 固相萃取柱可以对猪各种基质进行很彻底的净化，氟甲喹和噁喹酸出峰位置无基质干扰，可以进行准确的定性和定量分析。该方法的定量限为 20 pg/kg， 以三倍信噪比计算得到方法检测去为 5 pg/kg。 11- 在20、100 和300 pg/kg 的加标水平下，三种猪组织中的氟甲喹和噁喹酸的平均回收率范围分别为 71.8%-99.5%和75.8%-99.9%，且相对标准偏差小于15%，如表2-4所示。 0 2 4 6 8 10 12 14 min 猪肾空白 从 0 2 0 2 4 6 8 10 12 14 min 猪肝空白 综上所述，该方法具有良好的精密度和稳定性，适用于检测不同猪肉组织中的氟甲喹和噁喹酸残留量。 表2.猪肉中氟甲喹、噁喹酸加标回收实验结果 检测药物 加标浓度(pg/kg) 测定批次 回收率(%) 批内RSD 批间RSD 平均回收率(%) 氟甲喹 20 1 76.3 79.3 81.3 3.2 6.3 78.9 78.7 79.6 78.0 1.0 78.8 87.0 91.6 84.6 4.0 87.7 100 1 94.4 89.3 85.2 5.2 5.1 89.6 92.1 93.7 87.9 3.3 91.2 95.9 99.7 99.9 2.3 98.5 300 1 98.9 98.1 96.7 1.1 1.8 97.9 95.6 98.5 98.1 1.6 97.4 90.2 99.7 93.9 5.1 94.6 噁喹酸 20 79.1 80.8 84.3 3.3 7.9 81.4 85.2 77.8 80.3 4.7 81.1 89.4 93.7 95.7 3.5 93.0 100 1 86.6 86.8 87.6 0.6 8.5 87.0 87.2 85.3 85.9 1.2 86.1 99.8 100.1 99.9 0.2 99.9 300 1 100.0 99.6 92.0 4.6 1.1 97.2 99.9 97.8 98.8 1.1 98.9 99.5 99.6 98.3 0.7 99.1 0 2 4 6 8 10 12 14 min 图3.不同基质中20 pg/kg 加标水平样品和空白样品的色谱图 表3.猪肝中氟甲喹、噁喹酸加标回收实验结果 检测药物 加标浓度 (pg/kg) 测定批次 回收率(%) 批内RSD 批间RSD 平均回收率(%) 氟甲喹 20 1 91.5 98.6 93.7 3.9 2.7 94.6 100.0 99.9 98.8 0.7 99.6 97.9 99.8 97.3 1.4 98.4 100 1 78.0 83.7 71.2 8.8 9.2 77.6 72.5 72.7 70.4 1.8 71.8 85.3 83.1 90.2 4.0 86.2 300 1 91.1 83.9 92.3 4.9 11.2 89.1 92.2 98.6 97.9 3.6 96.2 79.9 74.3 76.5 3.7 76.9 噁喹酸 20 1 79.5 80.7 77.1 2.4 9.1 79.1 79.6 84.2 78.0 3.2 81.3 98.4 95.6 86.2 7.4 93.4 100 1 75.6 81.4 73.4 5.6 12.3 76.8 76.3 75.9 75.4 0.6 75.9 95.6 87.7 98.4 5.6 93.9 300 83.0 86.6 81.9 3.0 9.7 83.8 80.3 82.1 76.6 3.7 79.7 96.1 92.8 98.5 2.9 95.8 表4.猪脂肪中氟甲喹、噁喹酸加标回收实验结果 检测药物 加标 浓度 (ug/kg) 测定 批次 回收率(%) 批内RSD 批间RSD 平均 回收率(%) 氟甲喹 20 80.4 80.3 83.8 2.4 6.6 81.5 92.1 99.8 86.1 7.4 92.7 IN! 82.8 86.1 85.8 2.1 84.9 100 1 78.7 79.6 84.0 3.5 1.5 80.8 80.2 77.9 81.2 2.1 79.8 81.6 81.1 83.9 1.8 82.2 300 1 81.4 80.0 77.5 2.5 2.3 79.6 80.7 79.0 76.2 2.8 78.6 82.7 83.0 80.9 1.4 82.2 噁喹酸 20 77.6 82.6 72.5 6.5 4.4 77.6 90.3 75.4 76.8 10.2 80.8 86.5 80.9 86.6 3.9 84.6 100 78.4 83.5 81.2 3.1 2.5 81.1 79.6 81.2 81.1 1.1 80.6 87.1 80.8 85.1 3.8 84.4 300 1 78.6 80.6 80.9 1.6 1.8 80.0 80.0 84.9 82.0 3.0 82.3 82.9 81.5 83.4 1.2 82.6 ( 1.李倩，张玉洁等.高效液相色谱法检测多种动物组织中噁喹酸和 氟甲喹残留量的研究，中国兽医杂志2015，49(8)： 35-38 ) ( 2. 中华人民共和国农业部公告第235号动物性食品中兽药最高残留限量 ) 消耗品 部件号 Agilent Bond Elut C18， 100 mg， 3mL， 50/包 12102099 Agilent Bond Elut C18， 100 mg， 3 mL， 500/包 52102024 Agilent Zorbax Eclipse PLUS C18， 4.6×250 mm， 5.0 pm 959990-902 Agilent VacElut 20 固相萃取装置 12234104 Agilent Captive 尼龙膜， 0.2 pm， 13 mm 51914286 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) 噁喹酸和氟甲喹属于第二代喹诺酮类抗菌药，氟甲喹也是目前唯一不与人类共用的一种广谱型抗菌兽药，属于氟哌酸的替代产品。随着噁喹酸和氟甲喹在兽医临床上的广泛应用，由于其耐药性和潜在的致癌性。农业部第 235 号公告中规定的猪肉肌肉、肝脏和脂肪组织中氟甲喹的最大残留限量分别为 500 μg/kg、500 μg/kg 和 1000 μg/kg，猪肌肉、肝脏和脂肪组织中噁喹酸的最大残留限量则分别为 100 μg/kg、50 μg/kg 和 50 μg/kg。本方法采用 Agilent Bond Elut C19 固相萃取柱结合液相色谱-荧光检测器，成功开发出了不同猪组织中氟甲喹和噁喹酸的分析方法。该方法具有良好的精密度和稳定性，适用于检测不同猪肉组织中的氟甲喹和噁喹酸残留量。图 1. 噁喹酸、氟甲喹的标准曲线