水产品中磺胺类化合物检测方案(浓缩仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F004 水产品中磺胺类化合物的测定解决方案 1.介绍 磺胺类药物(Sulfonamides， SAs) 是指具有对氨基苯磺酰的结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。水产养殖业中常将磺胺类药物作为防治细菌性竖鳞病、烂鳃病等广泛应用。但是磺胺药会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，使其在水产品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已备受关注，如存在的毒副作用，可使人产生脱敏性皮炎和肠胃问题，造血及肾脏损伤等，成为人类亟待解决的问题之一。 图1.18种磺胺类抗生素结构图 本方案参考农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留的测定液相色谱-串联质谱法》，采用酸化乙腈对目标化合物进行提取。由于标准中只进行了简单的除脂，提取液中仍含有大量的样品基质，容易干扰后续的液质测试。所以本方案采用 HLB 柱对提取液进行净化，使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。 关键字：全自动固相萃取；均质器；浓缩仪；高效液相色谱-串联质谱；磺胺类化合物 2.仪器与试剂 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站； Raykol AH-30 全自动均质器； Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪； Raykol MPE-16 高通量真空平行浓缩仪； Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪； Agilent 1260 高效液相色谱 (HPLC)， Agilent6410 质谱检测器(MS)； HLB固相萃取柱 (CNW， 500 mg/6 mL)； 甲醇(优级纯)，水； Na2EDTA (0.1 mol/L) -MCIlvaine (0.1M)缓 冲溶液(pH=4.0)，准确 60.2g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠17.8 g和柠檬酸21.0 g与烧杯中，加入1000 mL的纯净水，加入浓盐酸调节pH值至4.0.如果该缓冲液在放置过程中易析出晶体，那么请将浓度减半进行配制。 3.标准溶液的配制 将1000.0 Hg/mL 的单标储备液取出，于室温平衡后用 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站配成浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 Hg/mL的标准工作曲线。 序号 命令 源液位 源液浓度 源液体积(mL 目标位 目标浓度 目标体积(mL 溶剂 洗针溶剂 1 填充管路 3.00 10%乙青水 2 配液 A1-18 1000.00 1.50| A21 10.00 1.00 10%乙腈水 10%乙腈水 3 直接稀释 A21 10.00| 1.00 A22 1.00 1.00 10%乙青水 10%乙腈水 4 直接稀释 A22 1.00| 1.00| A31 0.01 1.00 10%乙腈水 10%乙腈水 5 直接稀释 A22 1.00| 1.00 A32 0.02 1.00 10%乙青水 10%乙腈水 6 直接稀释 A22 1.00 1.00 A33 0.05 1.00 10%乙腈水 10%乙青水 7 直接稀释 A21 10.00 1.00 A34 0.10 1.00 10%乙青水 10%乙青水 8 直接稀释 A21 10.00 1.00 A35 0.20 1.00 10%乙青水 10%乙腈水 9 方法结束 4.样品前处理 4.1固相萃取净化 全自动固相萃取仪 固相萃取柱 活化 淋洗 洗脱 4.2提取 准确称取搅碎后的新鲜鱼肉样品5.0g于50mL离心瓶中，加入2.0 g无水硫酸钠，加入20 mL酸化乙腈进行提取，用 AH-30全自动均质器均质1.0min， 3800 rpm离心5.0 min， 重复一次。取上清液于250mL分液漏斗中，加入15 mL 乙腈饱和的 正己烷，振摇20s，静置取下层乙腈溶液。将所得乙腈溶液于 MPE-16 高通量真空平行浓缩仪浓缩至近干， 加入10 mL Na2EDTA (0.1mol/L)-McIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH=4.0)，摇匀备用。 分别以5mL甲醇和5 mL 甲酸水溶液(pH4.0)活化HLB柱(Oasis 500 mg， 6 mL)后，将上述样品溶液以2mL/min 的速度进行上样，并用3mL的甲酸水溶液(pH4.0)溶液清洗样品瓶。以20%的甲醇甲酸水溶液溶液(pH4.0)对固相萃取柱进行淋洗除去残留的无机盐和残留基质。在 20 psi 的氮气流下吹干 HLB柱，最后以10 mL 的甲醇洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图2)。将所得洗脱液用 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪浓缩至近干，加入10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)定容至1mL，上机测试。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间[min] 1 清洗样品通道 CH30H 60 5 1.5 2 活化 CH30H 废液1 5 5 1.4 3 活化 pH4.0 Form... 废液1 4 5 1.7 4 上样 废液1 3 10 4.1 5 清洗样品瓶 pH4.0 Form... 废液1 60 3 1.8 6 淋洗 Methol(20%... 废液1 5 5 1.4 7 气推 废液1 10 10 1.8 8 吹干 10 9 清洗注射泵 CH30H 40 2 0.4 10 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 11 气推 收集 10 5 1.1 12 结束 图2.Fotector Plus固相萃取净化方法 5.检测条件 5.1色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5m×21 mm×50mm 流速 0. 200 mL/min 流动相 A： 10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)，B： Methanol 柱温 35℃ 进样体积 10 uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-1.5 min， 93%流动相A； 1.51-3.0 min， 60%的流动相A； 3.01-5.5 min， 10%流动相A， 保持2 min； 5.51-6.0 min， 93%的流动相A；6.01-10.0 min， 93%的流动相A。 5.2 MRM参数 表1.18种磺胺类抗生素串联质谱检测参数 Compound Name Precursor Ion Product Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Ion Energy Voltage 磺胺醋酰 215 155.9 15 63 9 4 108 15 63 17 磺胺嘧啶 251 185.1 15 103 13 4 156 15 103 9 4 磺胺噻唑 256 156 15 98 9 4 108.1 15 98 21 4 磺胺吡啶 250 184.1 15 13 4 155.9 15 13 4 磺胺甲基嘧啶 265 15 13 4 15 13 甲基苄胺 291 261.1 15 142 21 4 230.1 15 142 21 4 磺胺二甲基嘧啶 279 186 15 107 13 4 155.9 15 107 13 4 磺胺甲噻噁唑 271 156 15 88 9 4 15 88 21 4 磺胺对甲氧嘧啶 281.1 15 112 21 4 281 215.1 15 117 13 4 磺胺6-甲氧基嘧啶 156 15 117 13 4 磺胺甲氧哒嗪 281 156 15 107 13 4 75 明秋丝号号莱8TY1 暴89 6 9OI 9I 807IO8 潮敷9I 9OI 9T 99ILI 08 9T 69I9I8 私和潮OT O8I 9T 89IOZ 90T ISIT897 和勤青由二纵ZI 90I 9I 99I6 SOI 9T ILTI97 和勤晋由SI SOI SI 9919Z LTT SI 80TTIS 0由二潮ST LII 9T 991LI 99TITIS 由二回9I I9TZIZ 86 CI T80T9876 86 9I 99T97 L01 9I 80I 6.样品测试 6.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需用空白样品提取液来配制标准工作曲线。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重 相等，拟合出工作曲线，要求R>0.995；此曲线两周需要重新配置一次。 6.2样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向鳗鱼样品(5g)中分别加入上述18中磺胺类抗生素(20uL，1mg/L， n=3)进行加标回收验证，测试结果如表 2所示。18种磺胺类抗生素的回收率在84-96%之间，RSD 值均小于10%，说明该方法能够很好地运用于水产品中18种磺胺类抗生素的检测。 表2.18种磺胺的加标回收率及 RSD 值(20 ng/L) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 Average RSD (%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Recovery (%) 磺胺醋酰 101.36 95.04 93.83 96.74 4.18 磺胺嘧定 97.67 85.82 81.12 88.20 9.67 磺胺噻唑 95.59 87.27 82.01 88.29 7.75 磺胺吡啶 99.44 89.13 86.31 91.63 7.54 磺胺甲基嘧啶 92.89 84.50 84.78 87.39 5.45 甲基苄胺 97.27 89.24 87.22 91.25 5.83 磺胺二甲嘧啶 94.02 87.77 84.89 88.89 5.25 磺胺甲噻噁唑 92.77 84.78 83.41 86.99 5.81 磺胺对甲氧基嘧啶 93.25 88.79 87.59 89.88 3.32 磺胺邻甲氧嘧啶 91.64 87.29 82.25 87.06 5.40 磺胺甲氧哒嗪 92.10 85.41 80.74 86.09 6.63 磺胺氯哒嗪 87.86 83.50 80.97 84.11 4.15 磺胺间二甲氧嘧啶 97.13 90.29 81.86 89.76 8.53 磺胺邻二甲氧嘧啶 102.92 96.92 87.91 95.92 7.88 磺胺甲基异噁唑 91.23 89.34 85.72 88.76 3.15 磺胺二甲基噁唑 88.69 88.64 84.53 87.29 2.73 磺胺喹噁啉 91.03 86.70 82.55 86.76 4.89 磺胺苯吡唑 97.45 95.33 87.83 93.54 5.40 7.结果与结论 7.1水产品及其制品成分复杂，应采用20%的酸化甲醇进行淋洗，可以有效地除去部分杂质，降低样品分析步骤的基质抑制效应。 7.2洗脱液氮吹应至近干，磺胺和沙星类化合物的回收率稳定。但氮吹时间如果过长，样品浓缩干燥，则待测化合物可能以固态颗粒的形式随着氮吹气流飞走而损失。 8.解决方案的优势 睿科 AH-30全自动均质器实现多任务的高通量均质，完全取代了手动均质的过程。一次最多处理32个样品，大大提高工作效率。 睿科Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作 站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密性和准确性。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 MPE 真空平行浓缩仪/AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪，大大地提高了样品前处理效率，真正完全解放实验室人员劳动。 网址：www.raykol.com 邮箱：info@raykol.com热线： 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。水产养殖业中常将磺胺类药物作为防治细菌性竖鳞病、烂鳃病等广泛应用。但是磺胺药会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，使其在水产品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已备受关注，如存在的毒副作用，可使人产生脱敏性皮炎和肠胃问题，造血及肾脏损伤等，成为人类亟待解决的问题之一。本方案参考农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留的测定 液相色谱-串联质谱法》，采用酸化乙腈对目标化合物进行提取。由于标准中只进行了简单的除脂，提取液中仍含有大量的样品基质，容易干扰后续的液质测试。所以本方案采用HLB柱对提取液进行净化，使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。