水产品中大环内酯类化合物检测方案(浓缩仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F003 水产品中大环内脂类化合物的测定解决方案 1.介绍 大环内酯类(Macrolides)(图1.9种大环内脂抗生素结构图)是由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素、因分子中含有一个内酯结构的十四员或十六员大环而得名。属十四员大环的抗生素有红霉素、罗红霉素和竹桃霉素；属十六员大环的有吉他霉素、替米考星、泰乐霉素、螺旋霉素和交沙霉素等。过多地使用大环内脂类药物会对人体消化道产生极强的副作用，使人恶心，干呕，腹胀腹泻等，严重的可致人不可逆的耳聋。大环内脂类药物在养殖业中的应用较为普遍，然而近年来多起抗生素药物残留超标事件使得水产品的安全性也遭到了质疑。各国制定的食品药物残留标准要求对我国水产品进出口造成了一定的影响，也对我国的水产养殖提出了更高的要求。 本方法参考 GB/T20762-2006 方法中对大环内脂的检测，采用乙腈对目标化合物进行提取，以HLB柱对样品进行净化，最终采用液质联用实现对大环内脂的检测。 图1.9种大环内脂抗生素结构图 关键字：全自动固相萃取；均质器；浓缩仪；高效液相色谱-串联质谱；大环内脂类抗生素 2.仪器与试剂 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol AH-30 全自动均质器 Raykol MPE 16 高通量真空平行浓缩仪 Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 Agilent 1260 高效液相色谱 (HPLC)， Agilent6410 质谱检测器(MS) HLB固相萃取柱(CNW， 500 mg/6 mL)甲醇(优级纯)，水0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液：取6g磷酸氢二钠溶解于450 mL水中，用氢氧化钠溶液调节 pH=8，用水定容至500 mL。 3.标准溶液的配制 将1000.0 Hg/mL 的单标储备液取出，于室温平衡后用 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站配成浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.50 Hg/mL的标准工作曲线。 A盘 B盘 C盘 D盘 目标位 目标浓度 目标体积(mL 洗针溶剂 序号 命令 源液位 源液浓度 源液体积(mL 目标位 目标浓度 目标体积(mL 溶剂 洗针溶剂 1 填充管路 3.00 50%乙腈水 2 配液 A1-9 1000.00 1.50 A21 10.00I 1.00 50%乙腈水 50%乙腈水 3 直接稀释 A21 10.00 1.00| A22 1.00 1.00 50%乙青水 50%乙腈水 4 直接稀释 A22 1.00 1.00| A31 0.01 1.00 50%乙腈水 50%乙腈水 5 直接稀释 A22 1.00 1.00| A32 0.02 1.00 50%乙腈水 50%乙腈水 6 直接稀释 A22 1.00| 1.00| A33 0.05 1.00 50%乙腈水 50%乙腈水 7 直接稀释 A21 10.00 1.00| A34 0.10 1.00 50%乙腈水 50%乙青水 8 直接稀释 A21 10.00 1.00 A35 0.50 1.00| 50%乙腈水 50%乙青水 9 方法结束 4.样品前处理 4.1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 固相萃取柱 活化 淋洗 洗脱 4.2提取 准确称取搅碎后的罗非鱼样品5.0 g于50 mL离心瓶中，加入2.0g无水硫酸钠，加入20 mL 乙晴，用 AH-30全自动均质器均质1.0 min， 3800 rpm离心5.0min， 残渣再用20mL 乙腈提取一次。合并2次上清液于 250 mL分液漏斗中，加入20mL乙腈 饱和的正己烷，振摇20s，静置取下层乙腈溶液。将所得乙腈溶液于 MPE 16 高通量真空平行浓缩仪浓缩至近干，加入10 mL 磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)，摇匀备用。 4.3净化 分别以5mL甲醇和5mL 水活化 HLB 柱 (Oasis500 rmg， 6mL)后，将上述的样品液以 2 mL/min的速度进行上样，并用 3mL 的水溶液清洗样品瓶。以10 mL水对固相萃取柱进行淋洗除去残留的无机盐；以30%的甲醇水溶液对固相萃取柱上的杂质进行淋洗。在20 psi 的氮气流下吹干 HLB柱，最后以 10 mL 的甲醇洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图2)。将所得洗脱液在 AutoEVA-60全自动平行浓缩仪上浓缩至近干，温度为40℃，加入50%乙腈水溶液定容至1mL，上机测试。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 时间(min) 1 清洗样品通道 CH30H 40 5 1.7 2 活化 CH30H 废液1 10 5 0.9 3 活化 H20 废液1 10 5 0.9 4 上样 废液1 2 10 5.8 5 清洗样品瓶 H20 废液1 100 3 2.3 6 淋洗 H20 废液1 20 10 1.1 7 淋洗 30%甲醇水溶液 废液1 10 5 0.9 8 气推 废液1 40 10 1.1 9 吹干 15 10 清洗注射泵 CH30H 10 5 0.9 11 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 12 气推 收集 10 5 1.1 13 结束 14 图2. Fotector Plus 大环内脂类化合物固相萃取方法 5.1色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5um×2.1 mm×50 mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A：10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 柱温 35℃ 进样体积 10uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-1.5 min，93%流动相A； 1.5-3.0 min， 60%的流动相A； 3.0-3.5 min 10%流动相A，保持2 min； 5.50-6.0 min， 93%的流动相A； 6.00-10.0 min， 93%的流动相A。 5.2 MRM 参数 表1.9种大环内脂的串联质谱检测参数 Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator 林可霉素 407 Voltage 359.1 20 128 13 7 126 20 128 29 7 174.1 20 215 37 7 克林霉素 425 377.2 20 150 17 7 126.2 20 150 29 7 替米考星 869 696.5 20 215 41 7 174.3 20 215 49 红霉素 734 576.4 20 160 13 158.1 20 160 29 泰乐霉素 916 145.1 20 215 41 174.1 20 215 37 215.2 20 215 22 7 吉他霉素 772 174.2 20 215 29 109.1 20 215 41 7 罗红霉素 837 158.4 20 160 40 158.4 20 160 40 交沙霉素 828 174.1 20 215 33 109.1 20 215 49 螺旋霉素 843 174.2 20 185 25 109.1 20 185 41 7 °甲或工秋半日墨‘咖 暴明士入胖(qdd 09)秋泪明号号6Y 如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求R>0.995；此曲线两周需要重新配置一次。 6.2样品基质加标测试 取罗非鱼样品(5.0g)，加入上述9种大环内脂类标准品(20 uL， 1ug/mL)，进行加标回收验证(n=3)。测试结果如表2所示，9种大环内脂的平均回收率在 77.66-113.38%之间， RSD 值均控制在10%以内，说明该方法能够很好地运用于水产品中9种大环内脂的检测。 表2.9种化合物的加标回收率及 RSD 值(20ug/kg) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 Average RSD (%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Recoveries (%)) 林可霉素 74.33 77.96 80.71 77.66 4.12 替米考星 90.09 94.17 93.17 92.48 2.30 克林霉素 115.39 113.06 111.71 113.38 1.64 红霉素 88.83 88.58 91.37 89.59 1.72 泰乐霉素 86.40 82.98 96.29 88.56 7.81 吉他霉素 88.78 94.03 99.90 94.24 5.90 罗红霉素 90.13 79.34 82.28 83.92 6.65 交沙霉素 94.66 89.77 81.86 95.43 7.28 螺旋霉素 108.98 110.40 113.71 111.03 2.18 7.结果与结论 7.1大环内脂类化合物对酸碱性较敏感，在固相萃取净化前需要用磷酸盐缓冲液溶解残渣，控制样品液的pH值在合适范围内。 7.2洗脱液在氮吹步骤时应以吹至近干为宜，不可过于干燥，否则会导致回收率偏低。 8.解决方案的优势 睿科AH-30全自动均质器实现多任务的高通量均质，完全取代了手动均质的过程。 -次最多处理32个样品，大大提高工作效率。 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和 分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密性和准确性。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 MPE 真空平行浓缩仪/AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪，大大地提高了样品前处理效率，真正完全解放实验室人员劳动。 全自动均质器 全自动液体样品处理工作站 均质 高通量真空平行浓缩仪 全自动固相萃取仪标曲配制 预浓缩 净化 全自动平行浓缩仪浓缩 邮箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com热线： 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 大环内酯类（Macrolides）是由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素、因分子中含有一个内酯结构的十四员或十六员大环而得名。属十四员大环的抗生素有红霉素、罗红霉素和竹桃霉素；属十六员大环的有吉他霉素、替米考星、泰乐霉素、螺旋霉素和交沙霉素等。过多地使用大环内脂类药物会对人体消化道产生极强的副作用，使人恶心，干呕，腹胀腹泻等，严重的可致人不可逆的耳聋。大环内脂类药物在养殖业中的应用较为普遍，然而近年来多起抗生素药物残留超标事件使得水产品的安全性也遭到了质疑。各国制定的食品药物残留标准要求对我国水产品进出口造成了一定的影响，也对我国的水产养殖提出了更高的要求。本方法参考GB/T20762-2006方法中对大环内脂的检测，采用乙腈对目标化合物进行提取，以HLB柱对样品进行净化，最终采用液质联用实现对大环内脂的检测。