45种氨基酸中UPLC-MS/ MS分析检测方案(液相色谱仪)

[应用纪要]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] 在生物医学研究中究用Kairos氨基酸试剂盒对45种氨基酸进行UPLC-MS/MS分析 Padhraic Rossiter、Jaime Salcedo Dominguez、Jennifer Warren、Norma Breen'、Lisa Calton² 沃特世公司(爱尔兰韦克斯福德)；?沃特世公司(英国威姆斯洛) 应用优势 色谱方法具有出色的分析选择性，可以分离同分异构体 分析运行时间短(<10 min) 峰检测的可信度高 灵活性更高，系系统可用于其它分析 沃特世解决方案 Kairos 氨基酸试剂盒 AccQ-Tag"Ultra"3x"衍生化试剂盒 CORTECSUPLCC18 1.6 um， 2.1×150 mm 色谱柱 ACQUITY"UPLCI-Class系统(FL) XevoTO-S micro MassLynx"质谱软件 TargetLynx"应用管理软件 关键词 Kairos氨基酸试剂盒，氨基酸， Xevo TQ-Smicro， AccQ·Tag Ultra 简介 Kairos氨基酸试剂盒(仅供研究使用)设计使生物医学研究人员能够在10分钟内完成对多达45种生物相关氨基酸的分析。已在适用情况下使用更高级参比物质为试剂盒校准品进行赋值，从而提高分析结果的可信度。Kairos氨基酸试剂盒校准品中9种氨基酸的量值可溯源至日本国家计量院 (NMIJ CRM6011a-6018a，6022a)，另外8种可溯源至美国国家标准技术研究所(NIST SRM2389a)，其余氨基酸使用购自Sigma-Aldrich的TraceCERT标准品(如果适用)通过重量法制得。 本文将介绍使用Kairos氨基酸试剂盒对溶液中的45种氨基酸进行分析。使用配备CORTECS UPLC C18色谱柱的ACQUITYUPLCI-Class系统进行色谱分离，然后在Xevo TQ-S micro系统上进行检测(图1)。利用样品溶液对试剂盒和分析系统的性能进行评估；另外，出于生物医学研究目的，对NIST SRM 2389a物质和基质样品(尿液和血浆)进行分析。 图1.Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro联用系统。 所用的色谱条件可以分离亮氨酸、甲基组氨酸、丙氨酸和氨基丁酸同分异构体。 试剂盒 ：MS条件Kairos氨基酸试剂盒(部件号：： 1176004379) 系统： LC条件 系统： 带柱温箱(CH-A)的ACQUITY UPLC I-Class (FL) 进样针/定量环： 10 pL/10 pL 色谱柱： CORTECS UPLC C18， 1.6 um， 2.1×150mm (部件号：186007096) 保护柱： 在线过滤器(部件号：2205000343) 流动相A： 0.1%甲酸的水溶液 流动相B： 0.1%甲酸的乙腈溶液 弱清洗溶剂： 流动相A 强清洗溶剂： 流动相B 柱温： 55°℃ 进样体积： 2pL 流速： 0.5mL/min 梯度： 见表1 方法条件 表1.用于分离氨基酸的梯度表 时间 (min) %A %B 曲线 初始 99 1 初始 1 99 1 6 2 87 13 6 5.5 85 15 6 6.5 5 95 6 7.5 5 95 6 7.6 99 1 6 运行时间： 9 min Xevo TQ-S micro ：采集模式 多重反应监测(MRM)(详见附录表A和表 B) 极性： ESI+ 毛细管电压： 2.0 kV 离子源温度： 150°℃ 脱溶剂气温度： 1000°℃ 锥孔电压 30V 数据管理 带TargetLynx应用管理软件的MassLynx软件4.1版 试剂盒复溶 复溶冻干的Kairos氨基酸试剂盒时，请按照维护和使用手册 (部件号：720005448EN)进行操作。用2 mL0.1M HCI复溶校准品和QC样品，在室温下混合至少30 min， 确保所有物质完全溶解。 用2mL水复溶内标，在室温下混合10 min， 确保所有物质完全溶解。将样品瓶内容物转移至容量瓶中，使用试剂盒中提供的10%磺基水杨酸将其定容至10 mL。 试剂制备 制备Kairos氨基酸试剂盒试剂、硼酸盐缓冲液和AccQ·TagUltra"3X"衍生化试剂盒试剂时，请按照维护和使用手册进行操作。 硼酸盐缓冲液制备：将430pL0.5M NaOH水溶液加入衍生化试剂盒中提供的6mL硼酸盐缓冲液中(试剂1)。有效期：3个月。储存条件：室温 AccQ-Tag Ultra"3X"试剂：用1.5mL乙腈(试剂2A)复溶AccQ·TagUltra"3X"(试剂2B)。在55℃下加热10 min并涡旋混合。有效期：5天。储存条件：室温。AccQ·Tag Ultra复溶后，应储存在干燥器内。 样品制备 第1步 向1.5 mL Eppendorf管中加入50uL样品 第2步 加入50pL50pM的内标 第3步 涡旋混合5s 第4步 加入50pL水 第5步 涡旋混合5s 第6步 仅适用于高浓度样品-加入1000pL稀释剂(0.1M HCI) 第7步 在9000 g下离心15 min 第8步 向最大回收样品瓶中加入70uL硼酸盐缓冲液 第9步 向硼酸盐缓冲液中加入10pL上清液并移取混合液 第10步 加入20 pL AccQ·Tag Ultra"3X"试剂 第11步 涡旋混合5s 第12步 在室温下静置样品1 min 第13步 在55℃下加热10 min 第14步 进样2 pL 在精密度和准确度研究中，用0.1MHCl通过重量法为所有氨基酸制得浓度为20、150、400和700pM的样品组合，并另外为丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺制得浓度为2500pM的高浓度样品组合。 结果与讨论 分析高浓度样品之后，在后续的所有氨基酸空白进样中未观察到明显的系统残留污染(校准品1的检测器响应≤20%)。 在三天内连续配制样品组合并重复分析五次(n=15)来则定精密度，计算每组样品的日内和日间精密度(%CV)。每组样品的日内精密度≤6.9%CV，日间精密度≤16.3%CV(不含精氨基琥珀酸时≤13.9%CV)，平均日内和日间精密度≤13.9%CV，如表2所示。 表2.溶液中45种氨基酸的平均日内和日间分析精密度 为评估线性，在三天内每天对Kairos氨基酸试剂盒校准品进行分析。回归分析的结果表明，对于所分析的45种氨基酸，骏在考察的浓度范围内使用1/x加权均实现了线性拟合(表3)。各氨基酸的确定系数(r)均大于0.99，其中校准品的反算浓度处于标示值±15%的范围内(在LLOQ的浓度下除外，其反算浓度处于标示值±20%的范围内)。至少75%的校准品满足这一标准，三种以红色突出显示的分析物(羟脯氨酸、胱硫醚、精氨基琥珀酸)除外。 表3.溶液中Kairos氨基酸试剂盒的线性。*表示LLOQ浓度下的偏差。 在一天内对用0.1 M HCI制得的浓度范围为1-20uM的样品重复分析五次进行灵敏度评估。在分析物峰的信噪比≥10：1且重复分析的精密度≤20%CV的情况下，测定每种分析物的LLOQ。除S-硫基胱氨酸、精氨基琥珀酸(20pM)和肌肽(15pM)外，分析的所有45种氨基酸的LOQ均≤5pM，如表4所示。 表4.使用ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro联用系统评估溶液中Kairos氨基酸试剂盒的灵敏度 通过分析单独制备的备品以及NIST SRM 2389a(开始分析前，采用重量法将浓度稀释至400uM) 进行准确度评估。在检测的浓度范围内，所有样品的浓度偏差均≤±20.4%(范围为-18.5~+20.4%)，三种以红色突出显示的分析物(羟脯氨酸、胱硫醚、精氨基琥珀酸)除外。对于参比物质中存在的分析物， NIST SRM 2389a稀释后浓度计算值的浓度偏差≤±10.0%(范围为-10.0~+3.7%)，所有数据均汇总于表5中。 表5.溶液中Kairos氨基酸试剂盒的准确度 对尿液和血浆样品进行分析，证明该方法能够分析生理浓度下的氨基酸。图2所示为血浆样品中11种氨基酸的总离子流色谱图(TIC)和一张色谱图插图，该插图突出显示了同一血浆样品中-氨基丁酸、β-氨基异丁酸和α-氨基丁酸的色谱分离结果。 图2.血浆样品中11种氨基酸的总离子流色谱图(TIC)张一张色谱图插图，该插图显示了同一血浆样品中y-氨基丁酸、β-氨基异丁酸和α-氨基丁酸的分离结果。 图3显示了尿液样品中组氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸的色谱图和定量分析结果。 图3.尿液样品中组氨酸(188.5pM)、丙氨酸(72.4uM)和苯丙氨酸(13.7pM)的色谱图和定量分析结果。显示了信噪比(SNR)和峰面积。 结论 Kairos氨基酸试剂盒使生物医学研究人员能够通过一套灵活的试剂盒获得值得信赖的结果，利用这套试剂盒，他们能够在10分钟内使用ACQUITY UPLCI-Class/Xevo TQ-S micro联用系统对处于正常生理浓度范围内的42种氨基酸进行准确定量。 采用AccQ·Tag Ultra"3X"衍生化试剂盒对样品进行衍生化， 可通过简单、稳定且快速的反相UPLC方法分析氨基酸，无需使用流动相缓冲液或离子对试剂。这意味着无需专用系统，因此ACQUITY UPLCI-Class/Xevo TQ-S micro联用系统还可以用于其它分析。衍生化样品具有良好的稳定性，并且在所用的色谱条件下，研究人员在10分钟内即可分离氨基酸异构体，并提供可靠的峰鉴定结果。 Kairos氨基酸试剂盒(仅供研究使用)中所述的方法使研究人员能够使用ACQUITY UPLCI-Class/Xevo TQ-S micro联用系统对溶液中的42种氨基酸进行定量分析，并获得良好的精密度、线性、灵敏度和准确度。该试剂盒中的其余三种分析物(羟脯氨酸、胱硫醚和精氨基琥珀酸)仅适用于半定量分析。 仅供研究使用。不适用于诊断。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、 The Science of What’s Possible、Kairos、CORTECS、ACQUITY、UPLC、MassLynx、TargetLynx、AccQ·Tag和Xevo是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 扫一扫，关注沃特世微信沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-5209 3866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)8202676 附录 表A.氨基酸分析物的MRM参数 表B.内标的MRM参数 内标 MRM通道 碰撞能量 (m/z) (eV) 丙氨酸℃315N 264.20>171.10 20 甘氨酸c，15N 249.20>171.10 20 异亮氨酸c6N 309.20>171.10 20 亮氨酸c6N 309.20>171.10 20 苯丙氨酸C915N 346.20>171.10 20 缬氨酸 C5N 294.20>171.10 20 苏氨酸C4N 295.20>171.10 20 丝氨酸 C3N 280.20>171.10 20 酪氨酸c。1N 362.20>171.10 20 谷氨酰胺 C5N 324.20>171.10 20 精氨酸coN4 355.20>171.10 20 赖氨酸1c15N， 248.10>171.10 15 脯氨酸csN 292.20>171.10 20 天冬氨酸C4N 309.20>171.10 20 胱氨酸C6N2 295.10>171.10 15 谷氨酸1cg15N 324.20>171.10 20 组氨酸1cN3 335.20>171.10 20 蛋氨酸 C5'N 326.20>171.10 20 色氨酸cnN2 388.20>171.10 20 天冬酰胺c15N2 309.20>171.10 20 Kairos氨基酸试剂盒（仅供研究使用）设计使生物医学研究人员能够在10分钟内完成对多达45种生物相关氨基酸的分析。已在适用情况下使用更高级参比物质为试剂盒校准品进行赋值，从而提高分析结果的可信度。Kairos氨基酸试剂盒校准品中9种氨基酸的量值可溯源至日本国家计量院（NMIJ CRM 6011a-6018a，6022a），另外8种可溯源至美国国家标准技术研究所(NIST SRM 2389a)，其余氨基酸使用购自Sigma-Aldrich的TraceCERT标准品（如果适 用）通过重量法制得。本文将介绍使用Kairos氨基酸试剂盒对溶液中的45种氨基酸进行分析。使用配备CORTECS UPLC C18色谱柱的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分离，然后在Xevo TQ-S micro系统上进行检测。利用样品溶液对试剂盒和分析系统的性能进行评估；另外，出于生物医学研究目的，对NIST SRM 2389a 物质和基质样品（尿液和血浆）进行分析。