食品中脂溶性维生素ADE检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 采用ACQUITY Arc二维液相色谱法同时分析食品中的脂溶性维生素ADE 秦雨虹，黄德凤，陈静 应用优势 二维柱切换-紫外检测法只要进样一次即可将维生素A、D、a/β/y/6-E全部分离，极大提高分析效率； 利用二维液相中心切割法分析维生素D，可在一维色谱柱实现净化，二维色谱柱上实现维生素D，和Ds的分离。同时减少色谱峰重叠现象，降低复杂基质成分对维生素D2和Ds测定的干扰。 沃特世解决方案 ACQUITY Arc 2D技术 Empower 3色谱控制软件 XSelect HSS C.SB色谱柱 (3.0X150 mm， 3.5 pm) ( XBridge BEHC Direct Connect HP捕集柱 (2.1mmX30 mm， 10 pm) ) 关键词二维液相色谱，中心切割，维生素ADE 简介 维生素A、D、E是机体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素。维生素A1又称为视黄醇，具有促进机体生长、维持表皮完整等功能。维生素D主要包括维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)，对哺乳动物具有促进钙磷代谢及成骨作用。维生素E又称为生育酚，由于母生育酚环上甲基取代的变化有8种活性形式，包括a、β、y、6一生育酚等，其中a一生育酚因为活性最高，具有抗氧化、抗衰老等作用，在食品科学中通常被单独考虑1。婴幼儿及成人配方乳品和动物饲料是脂溶性维生素强化的两种重要形式。在实际样品中，维生素A和维生素E通常添加量较高，受基质干扰较小，可直接测定；而维生素D的添加量一般较少，紫外吸收也相对较弱，同时受基质干扰严重，因此现有的国家标准方法采用液质联用或半制备正相净化的方式对其进行分离检测2。但是液相色谱质谱联用方法成本相对较高；而正相方法易受流动相等条件影响，同时过程相对繁琐，耗时长。 本应用在沃特世已有的超高效二维液相色谱(UPLC2D)方案的基础上3，采用ACQUITY Arc(UHPLC)2D技术，在反相条件下，一次进样同时完成维生素A， a、β、y、6-维生素E和维生素D2、D3的分离测定，耗时只需15分钟。维生素A和a、β、y、6-维生素E在一维进行分离定量，而维生素D在一维经过初步分离净化后中心切割至捕集柱，再进入二维色谱柱进一步分离测定，实现对维生素D2和D3的基线分离。 通过对相关企业提供的实际样品进行基质添加考察，以及对QC样品的分析，结果表明，维生素A， 维生素E和维生素D按国标要求范围内线性良好，标准曲线相关系数，重现性佳，5针重复进样保留时间RSD<0.5%，峰面积RSD<2%，维生素D(D2、D3)检出限可达到0.5 ug/kg。 实验 LC条件 仪器系统： Waters ACQUITY Arc 2D 系统：QSM1(四元泵1)+ QSM2(四元泵2)+ FTN进样器+Column Manager (CM-A)柱温箱， 内置2位-6通阀+ 2998PDA检测器 流动相： A： 水； B：乙青；C：甲醇 一维分析色谱柱： Poroshell 120 PFP (4.6x100 mm， 2.7 pm) 二维分析色谱柱： XSelect HSSCSB (3.0X150 mm， 3.5 pm) 捕集柱： XBridge BEH CDirect Connect HP捕集柱 (2.1mm x 30 mm，10 pm) 柱温： 一维35°℃，二维40°℃ 检测波长： 一维VA： 325nm(0-5.5 min)； VD：264 nm(5.5-6.8 min)； VE：294 nm (6.8-10min)； 二维VD2和VD3： 264nm(10-15 min) 进样量： 10pL 梯度方法： 一维 时间 流速 (mL/min) A(%) B(%) C(%) Curve 0 1 20 0 80 6 9 1 0 0 100 6 10 1 0 0 100 6 11 1 20 0 80 6 15 1 20 0 80 6 二维 时间 流速 (mL/min) A(%) B(%) C(%) Curve 0 0.5 0 100 0 6 4 0.5 0 100 0 6 10 0.5 0 20 80 6 10.5 0.5 0 100 0 6 15 0.5 0 100 0 6 阀切换时间： 0 min 5.74 6.04 8.5 min min min 15 min 右阀位置 2 1 2 2 2 左阀位置 1 1 1 2 1 实验方法 样品前处理 本应用考察样品为奶粉实际样品，样品提供及处理由合作实验室提供。样样前 处理步骤参考《GB5009.82-2016食品中维生素A、D、E的测定》?执行。具体过 程如下： 皂化 称取2-5g经均质处理的固体试样(或50g液体试样)于150mL平底烧瓶中，固体 试样加入20mL温水，混匀； 含淀粉样品：加入0.5-1g淀粉酶，放入60℃水浴避光光温振荡30min后，取出； 将上述处理液中加入1.0g抗坏血酸和0.1g BHT，混匀，加入无水乙醇30mL，氢氧 化钾10mL，80°℃水浴皂化30 min， 冷却至室温。 提取 将皂化液用30mL水转入250mL分液漏斗中，加入50mL石油醚-乙醚混合液，振荡 萃取5 min， 将下层溶液转移至另一20mL分夜漏斗中； 将下层溶液转移至另一250mL分液漏斗中，加入50mL混合醚液再次萃取； 合并两次萃取液。 注：如果只测维生素A和a-生育酚，可用石油醚作提取剂。 洗涤用约100mL水洗涤醚层，约需重复3次，直至将醚层洗至中性(可用pH试纸检测下层溶液pH值)；去除下层水相。 浓缩 将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中， 用15mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内； 40℃水浴减压蒸馏或者气体浓缩至约2mL，微量氮气吹干； 用甲醇分次将蒸发瓶中残留物转移并定容至10mL， 溶液过0.22um有机系滤膜，上 机测试。 注：当待测维生素D含量较低，需要扩展进样体积时，可适当稀释溶剂强度以降低溶 剂效应(如使用初始流动相转移残留物并定容)。 图1.样品前处理流程。 仪器连接配置 第一维测定维生素A和维生素E， 中心切割后第二维分离测定维生素D。方法的关键在于第一维需将维生素A，E和基质干扰峰分离，并且第一维需要有非常好的重现性来保证中心切割的准确和切割窗口最小化。为了更直观的判断切割是否准确，并且能够在保留时间发生异常时及时方便的进行调整，故采用两个六通阀连接一个检测器，使得一、二维在同一个图谱上出峰。方法如下：维生素A、D、E过一维色谱柱，过检测器，均出峰，同时中心切割维生素D，使其在二维色谱柱上再进行一次分离，再次出峰。 本应用采用的具体配置见图2。 图2. Arc 2D二维系统中心切割系统连接配置。 结果与讨论 在第一维，首先确保在一维进行分离定量的维生素A和维生素E的4个异构体都与干扰杂质分离。另外，维生素D需在一维上与维生素A和E完全分离，并且使维生素D峰宽尽量窄，便于维生素D能够完全被切割和捕集，同时也避免切割到大量杂质从而影响维生素D在二维上的进一步分析。本应用中的连接配置优势在于，使用一个检测器，可随时根据不同实际样品中维生素D在一维色谱柱的出峰时间，灵活调整切割时间窗口大小，避免目标物在切换过程中的损损。 在第二维，将维生素D和基质干扰分离的同时，需要将维生素D2和维生素D3基线分离，以便达到定性和准确定量的目的。同时维生素D2和维生素D3出峰时间也要尽可能远离切阀的扰动峰和主要杂质峰，保证定量准确性。 从图3的标样分离谱图及图4的实际添加样品谱图可见，一维色谱柱可获得维生素A、四种维生素E异异体以及杂质的良好分离，第二维可获得2种维生素D与杂质的良好分离。 图3.维生素A、维生素E的4个异构体、维生素D2和D3的标准品谱图。 图4.实际奶粉添加样品谱图。 方法性能 重现性 5pg/L浓度标准品重复(n=5)进样结果如图5显示，一维上的维生素A，维生素E的4个异构体和二维上的维生素D2和维生素Ds保留时间RSD<0.5%， 峰面积RSD<2%，保证了中心切割方法的准确性。 图5.5ug/L浓度标准品重复进样谱图(n=5)。 线性 本应用在遵循国标要求的基础上考察了维生素A、维生素E的4个异构体、维生素D2和D3的线性，结果如图6所示，不同维生素在不同的线性范围内均保持良好线性关系，决定系数R²大于0.998。 图6.在不同线性范围内的标准曲线：维生素A(0.02-10mg/L)， 维生素E的4个异构体(2-60mg/L)，维生素D2和维生素D3(0.001-1mg/L)，进样量为250 pL。 检出限(LOD)与定量限(LOQ) 实际样品中，维生素A和维生素E的含量一般较高，能够准确定量，而维生素D含量量般较低，且较易被基质干扰，定量相对困难，因此，维生素D 的检出限是考察仪器方法的一个重要参数。本方法同时尝试了极限灵敏度分析，当在250uL进样条件下，实测维生素D2和维生素D3在0.5ug/L上机浓度下，信噪比S/N为11，如图7所示，因此将0.5 pg/L做为维生素D的LOQ，按照S/N=3计算，维生素D的LOD为0.17 pg/L， 该方法足够满足国家标准中液相方法50.0 pg/L最低标准曲线浓度点的检测要求， LOD和LOQ结果详见表1。因此，如样品中待测维生素D含量较高，前处理步骤中也可使用甲醇复溶，过0.22 pm 有机系滤膜待测，进样量10uL即可满足国标要求。 图7.维生素D2及D3定量限(0.5ug/L)。 表1.LOD与LOQ LOD 奶粉样品 LOQ 奶粉样品 (ug/L) (ug/100 g) (ug/L) (ug/100 g) 维生素D2 0.17 0.017 0.50 0.050 维生素D3 0.17 0.017 0.50 0.050 注：取样量为10g。 实际样品检测及基质效应评估 使用本应用建立的方法，对客户提供的奶粉样品进行分析。样品处理由客户按本文所述前处理方法进行。结果显示这批样品中添加的维生素多为维生素D3和a-维生素E。 基质效应的大小会对定量结果产生直接的影响，本应用同时进行了基质效应的评价。对上述客户提供的样品同时进行后加标处理，测试结果作为基质效应的评价依据。实际样品的测试结果及基质效应的评价见表2。 表2.实际样品的测试结果及基质效应 样品1 样品2 样品3 样品4 本底浓度 (mg/kg) 添加浓度 (mg/kg) 基质效应 (%) 本底浓度度添加浓度基基质效应 (mg/kg) (mg/kg) (%) 本底浓度 (mg/kg) 添加浓度 (mg/kg) 基质效应 (%) 本底浓度i汤 (mg/kg) 添加浓度 (mg/kg) 基质效应 (%) 维生素A 7.3 1.0 -18 8.2 1.0 -14 3.3 1.0 -5.0 9.5 1.0 -8.0 维生素6-E ND 1.0 -17 5.6 1.0 -10 ND 1.0 -13 ND 1.0 -7.0 维生素β-E ND 1.0 -15 ND 1.0 -12 ND 1.0 -11 ND 1.0 -9.0 维生素Y-E ND 1.0 -10 3.2 1.0 -20 2.1 1.0 -18 ND 1.0 -7.0 维生素a-E 29 1.0 -12 50 1.0 -19 49 1.0 -7.0 54 1.0 -8.0 维生素D2 ND 1.0 -3.0 ND 1.0 -5.0 ND 1.0 -14 ND 1.0 -4.0 维生素D3 0.067 1.0 -10 0.079 1.0 -13 1.2 1.0 -10 2.3 1.0 -9.0 注：ND为未检出。 结论 本应用基于二维液相色谱分离技术建立了快速、同时测定婴幼儿奶粉中中生素A、a/B/y/6-E、D2和D3分析方法。本方法简便、快速，自动化程度高，重现性好，准确度高，可作为配方奶粉或其他乳品中维生素A、a/β/y/6-E、D2和D3的测定方法推广应用。 ( 参考文献 ) ( 1.Mcmahon A， Christiansen S， Shinel，et al. JAOAC Int，2013，96 (5)：1073。 2.GB5009.82-201 6 .食品中维生素A、D、E的测定。 ) ( 3.ACQUITY UPLC 2 D技 术中心切割法同时测定奶粉样 品 中的维生素A，维生素E和维 生 素D，2016.沃特世方案。 ) 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-5209 3866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)820 2676www.waters.com 采用ACQUITY Arc维液相色谱法同时分析食品中的脂溶性维生素ADE 应用优势 1）二维柱切换-紫外检测法只要进样一次即可将维生素A、D、α/β/γ/δ-E全部分离，极大提高分析效率； 2）利用二维液相中心切割法分析维生素D，可在一维色谱柱实现净化，二维色谱柱上实现维生素D2和D3的分离。同时减少色谱峰重叠现象，降低复杂基质成分对维生素D2和D3测定的干扰。简介本应用在沃特世已有的超高效二维液相色谱(UPLC 2D)方案的基础上，采用ACQUITY Arc(UHPLC)2D技术，在反相条件下，一次进样同时完成维生素 A，α、β、γ、δ-维生素E和维生素D2、D3的分离测定，耗时只需15 分钟。维生素A 和α、β、γ、δ-维生素E在一维进行分离定量，而维生素D在一维经过初步分离净化后中心切割至捕集柱，再进入二维色谱柱进一步分离测定，实现对维生素D2和D3的基线分离。通过对相关企业提供的实际样品进行基质添加考察，以及对QC样品的分析，结果表明，维生素A，维生素E和维生素D按国标要求范围内线性良好,标准曲线相关系数，重现性佳，5针重复进样保留时间RSD<0.5%，峰面积RSD<2%，维生素D(D2、D3)检出限可达到0.5μg/kg。结论 本应用基于二维液相色谱分离技术建立了快速、同时测定婴幼儿奶粉中维生素A、α/β/γ/δ-E、D2和D3分析方法。本方法简便、快速，自动化程度高，重现性好，准确度高，可作为配方奶粉或其他乳品中维生素A、α/β/γ/δ-E、D2和D3的测定方法推广应用。